Tema 9: Técnicas de cuantificación de microorganismos

1-Introducción

Crecimiento: incremento ordenado de todos los componentes de un sistema.

  • En organismos pluricelulares: aumento del tamaño del individuo

  • en organismos unicelulares (fisión binaria ó gemación): aumento de la población

Clasificación del crecimiento:

  • Crecimiento individual: Es el incremento en el tamaño y peso y es usualmente un preludio a la división celular. La mayoría de los procariotas se dividen por fisión binaria.

  • Crecimiento poblacional: Es el incremento en el número de células como consecuencia del crecimiento y la división celular.

El crecimiento de poblaciones bacterianas (crecimiento poblacional) se mide:

  1. Estimando los cambios en el número (recuento) de células (células/ml, células/g, UFC/ml).

  2. Cambios en la cantidad de algún componente de las mismas (proteínas, ADN, nitrógeno, clorofilas…).

  3. Cambios en la propia masa de las células (biomasa: g/ml, mg/ml, µg/ml).

Estas determinaciones pueden llevarse a cabo mediante

  • Métodos directos

  • Métodos indirectos → Requieren gráficas o tablas de referencia que relacionen la medida concreta con la masa o el número de células obtenidos mediante un método directo

Estos métodos considerarán medidas de TOTALES (todas las células) o medidas de VIABLES, sólo aquellas células que son capaces de dividirse y formar descendencia.

2. Métodos de cuantificación de microorganismos

2.1.Métodos directos

2.1.1.Métodos directos para biomasa

Determinación peso húmedo (totales):

  • centrifugación de un volumen determinado de cultivo

  • eliminar el sobrenadante

  • pesar el sedimento

  • ventajas e inconvenientes: útil para grandes volúmenes de muestra. Agua intercelular retenida…

Determinación peso seco (totales):

  • centrifugación/filtración de un volumen determinado de cultivo

  • eliminar el sobrenadante (si es por centrifugación)

  • secar el sedimento o el filtro (110ºC)

  • enfriar en cámara de desecación

  • pesar (10-15% del peso húmedo)

  • ventajas e inconvenientes: se incluye todo, vivo y muerto.

2.1.2. Métodos directos de número o recuento

  • Recuento microscópico en cámara de recuento (totales y viables, mediante el uso de determinados colorantes)

  • Contador electrónico tipo Coulter (totales)

  • Citometría de flujo (totales y viables mediante el uso de determinadas sustancias como el yoduro de propidio, PI)

Cámaras de recuento

Dispositivo de vidrio similar a un porta. Se utilizan para contar visualmente con un microscopio el número de partículas por unidad de volumen de una muestra líquida.

Se trata por tanto de un método de RECUENTO DIRECTO DE TOTALES, útil para recuento de leucocitos, eritrocitos, trombocitos, bacterias, levaduras, esporas, polen etc y de VIABLES, si se utilizan colorantes específicos.

Hay distintos tipos de cámaras de recuento: Petroff-Hausser, Neubauer...

Todas consisten en una placa base en vidrio óptico especial con una serie de ranuras grabadas en la superficie y una o dos retículas de recuento con medidas muy concretas.

Cámara de Petroff-Hausser:

Zona de recuento:

  • 1 cuadro grande dividido en 25 cuadros medianos

  • 1 cuadro mediano en 16 pequeños

  • Lado de la rejilla (1 cuadro grande): 1mm

  • Superficie de la rejilla: 1 mm2

  • Profundidad: 0,02 mm

  • Volumen total de la rejilla: 0,02 mm3

Cámara de Neubauer

Estructura:

  • Rejilla con 9 cuadros grandes.

  • Lado de cada cuadro grande: 1mm

  • Lado de la rejilla: 3 mm

  • Profundidad: 0,1mm Volumen de 1 cuadro grande: 0,1 mm3

Zonas de recuento:

  • 4 cuadros grandes en las esquinas, para contar células de gran tamaño como leucocitos. Cada uno dividido en 16 o 25 cuadros medianos (según modelo)

  • 1 cuadro grande central, para contar células de pequeño tamaño como eritrocitos o trombocitos. Dividido en 25 cuadros medianos. Cada cuadro mediano en 16 pequeños.

Cámaras de recuento. Ventajas e Inconvenientes

  • Rápido, fácil, relativamente barato.

  • Células pequeñas.

  • Difíciles de ver.

  • Células móviles → necesario inmovilizarlas.

  • Errores visuales.

  • No adecuado para bajas densidades celulares.

Contador electrónico tipo Coulter:

Se hace pasar una suspensión bacteriana a través de un capilar o un poro que forma parte de un circuito eléctrico. El paso de cada partícula altera la conductividad y queda registrado en un contador. Sólo sirve para TOTALES.

Citómetro de Flujo:

Se hace pasar una suspensión bacteriana delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que se traducen en señales electrónicas que son digitalizadas. TOTALES y VIABLES si se utilizan adecuadas sustancias fluorescentes

Limitaciones:

  • No se visualiza la morfología celular

  • no apto para Microorganismos filamentosos

2.2.Métodos indirectos

2.2.1.Recuento en placa (viables)

Se basa en el principio de que una única célula viable o unidad formadora de colonia (UFC) originará una colonia visible, cuando se siembre en una placa con medio sólido.

Consiste en contar el número de colonias de la placa (que será el número de UFC) y hacer unos cálculos para determinar el número de UFC/ml en la muestra original.

Ventajas: fácil, gran sensibilidad, uso de distintos medios que aporten más información que el simple recuento.

Limitaciones: no siempre adecuado para muestras naturales.

Diluciones son de solución salida 9×10^-3

Se podría utilizar la misma punta de pipeta si vamos de menor a mayor concentración.

2.2.2.Recuento sobre filtros de membrana (Filtración por membrana) (viables)

2.2.3. Número más Probable (NMP) (viables)

Método para estimar la densidad de población de una muestra problema, basado en detectar la presencia o ausencia (tubos positivos o negativos, turbios o claros) de microorganismos en réplicas idénticas inoculadas con la muestra original. Se utilizan medios de cultivo líquidos apropiados.

Para el cálculo del NMP se utiliza la ecuación de Poisson de distribución al azar de partículas en una muestra → NMP en tabla.

2.2.4.Actividades metabólicas, microcalorimetría, componentes celulares

Medida de actividades metabólicas (viables):

  • Tasa de formación de productos metabólicos como gases, ácidos…

  • Tasa de utilización de un compuesto, como el oxígeno, la glucosa

Microcalorimetría (viables):

  • Cambios en la producción de calor resultante del metabolismo microbiano.

Medida de algún componente celular (totales y viables):

  • Cuantificar mediante un método analítico algún componente celular: Proteínas, ADN, ARN, Nitrógeno, ATP, clorofilas …

2.2.5. Turbidez. Espectrofotómeto. Escala de MacFarland.

Las suspensiones bacterianas aparecen turbias porque las células dispersan la luz que atraviesa la suspensión.

Cuantas más células haya mayor será la luz dispersada y mayor será la turbidez.

Ventajas:

  • Las medidas de turbidez son fáciles y rápidas de realizar.

  • No precisan modificación de la muestra, por lo que puede medirse repetidamente a lo largo del tiempo.

¿Cómo medimos turbidez?:

  • Espectrofotómetro

  • Escala de MacFarland

Espectrofotómetro

La turbidez de una suspensión podemos medirla mediante un espectrofotómetro que hace pasar la luz a través de la suspensión y mide la cantidad de luz transmitida o no dispersada.

El espectrofotómetro utiliza un prisma de difracción para generar luz incidente en una banda muy estrecha de longitudes de onda.

Para medir turbidez bacteriana se utiliza ʎ= 540nm (verde), ʎ= 600nm (naranja) y ʎ= 660nm (rojo).

Si la luz incidente tiene una intensidad I0 , tras pasar por la suspensión bacteriana, la luz transmitida I es menor que I0.

Transmitancia (T): es la relación entre la intensidad de luz transmitida por una muestra problema (I) y la intensidad de luz incidente sobre la muestra (I0).

Se expresa en unidades Klett T= I / I0

Absorbancia o Densidad óptica (DO): es la relación logarítmica entre luz incidente y la transmitida. DO es una magnitud adimensional A= D.O.= Log I0/I.

La Absorbancia (Densidad Óptica) y la Transmitancia son valores proporcionales a la masa o el número de microorganismos totales (UFC), dentro de ciertos límites.

Suspensiones de dos microorganismos diferentes pueden darnos un mismo valor de absorbancia que se corresponda con igual peso seco en ambas suspensiones pero distinto número de microorganismos totales (células pueden tener distinto tamaño).

Escala de MacFarland

  • La escala consta de 11 patrones (desde 0,5 hasta 10)

  • Tubos patrones: soluciones de cloruro de bario al 1% con ácido sulfúrico al 1% en volúmenes específicos → precipitado de BaSO4 .

  • Tubos patrones de turbidez con los que se puede establecer una relación entre dicha turbidez (por precipitación química) y la que presente una suspensión bacteriana problema.

  • De manera visual se comparan los tubos problema con los patrones (los cuales están asociados a una densidad de células de E.coli) pudiendo informar así del número de células/ml.