Sinalização Molecular RTKs

Sinalização RTKs

Receptores de Tirosina Cinase (RTKs)

• Transmissão de sinais por RTKs intrínsecos e associados

• Existem pelo menos 90 genes que codificam RTK no Homem.

• Ativação por sinais que controlam crescimento celular e diferenciação.

• Tipos de receptores envolvidos:

  • Receptores com atividade intrínseca de Tyr cinase (RTKs no domínio citoplasmático)

  • Receptores com atividade de Tyr cinase associada (permanente ou transiente)

Organização dos Domínios dos RTKs

• Estrutura Geral:

• Formados por uma única cadeia polipeptídica

• Podem ser monoméricos ou diméricos

• Exceção: Recetor da insulina é um heterotetrámero.

  • Domínio extracelular: Ligação ao ligando e glicosilação

  • Domínio transmembranar: Contém uma α-hélice (ligação a membrana)

  • Domínio citosólico:

    • Tirosina cinase

    • Ligação a proteinas efetoras com dominios SH2 e

    • Sequências com tirosinas (autofosforilação, fosforilações/desfosforilações catalisadas por cinases/fosfatase)

(locais de fosforilação or outro tipo de cinases em residos de serina trionina no dominio intracelular importante para terminar o recetor e a sinalização)

Mecanismos de Ativação dos RTKs

Na ausência de ligando, o domínio cinase do RTK está inibido.

• Ligação do sinal ao domínio extracelular resulta em:

  • Autofosforilação do receptor em trans

  • P-Tyr recruta proteinas efetoras

  • Tirosina cinase ativada - fosforila Tyr em proteinas efetoras

Quando um ligando chega ao alvo, há ativação do recetor

Pode ser ativado como: dimerização do recetor, autofosforiliza-se em trans

Cria local de docking de proteinas efetoras.

O docking é fosforilado pelo recetor e uma vez fosforiladas recrutam outras proteinas com dominios SH2 ou PTB

Ativação por dimerização ou conformacional

• Dois mecanismos de ativação:

  • a) Receptor monomérico: Ligando induz dimerização

  • b) Receptor dimérico: Ligando ativa alostericamente o receptor (alteração conformacional)

Autofosforilação dos RTKs

• Proteínas efetoras ligam-se a p-Tyr através de:

  • Domínios SH2, PTB ou C2

• Tipos de proteínas efetoras:

  • Enzimas ativadas por fosforilação em Tyr

  • Proteínas adaptadoras que sinalizam para outras vias

Proteinas efetoras: PLCγ - fosforilada pelo recetor tirosina cinase

Vias de Sinalização Ativadas por RTKs

• NADPH oxidase (por PLCγ)

• PI-3K

• PLCγ

• Ras

• Cdc42

Ativação por PI3K

• O PI3K fosforila lipidos de inositol do carbono 3 do anel e o seu substrato é o PIP2

• A ativação da PI3K e o IP3 são importantes para recrutar dominios PH para a membrana plasmatica (PKB por exemplo)

• Pode também ser ativada pela proteina Ras que pode ser ativada por recetores RTX assim como dímeros Beta-gamma (proteina G)

• PI3K transforma PIP2 em PIP3. Para a terinação desta reação, é necessário desfoforilar PIP3 em PIP2, pela fosfatase chamada PTEN

• Hiperativação desta via está associada a situação de cancro

• Mutação com inibição da PTEN leva a mais proteção da sobrevivencia celular

• Pode ser ativada por Ras (depois de ativação por RTK) e pelo dímero βγ da proteina G

• PI3K liga-se a p-Tyr em RTK ativado via domínios SH2 (subunidade reguladora p85)

• A subunidade catalítica (p110) é ativada

• PI3K é recrutada para o recetor e vai converter PIP2 em PIP3

• Alvos da PIP3- proteinas com dominios PH

Ativação da PKB/Akt

• A ativação completa requer dupla fosforilação por PDK1 e PDK2/ILK

região central de P por PDK1 e na zona regulatoria P por outras, como a mTORC2

Dominio PH é para ser recrutada para a membrana

terminação da sinalização do recetor - fosfatase PTEN pip3

Desfosforilação da PKB

que resulta na inibição da sua atividade, levando à regulação negativa da via de sinalização mediada por tirosina cinase.

Estrutura do Domínio e Sites de Fosforilação do PKB/Akt

• Fosfatases que vão desfoforilar o recetor de tirosina cinase

• Desfoforilação mediada por fosfatases da familia fosfotirosina fosfatases (PTP)

• Fosforilação em serinas trioninas, pode ser endocitado, ubiquitinado e degradado

• Terminação da sinalização:

  • Desfosforilação por fosfatases

  • Ubiquitinação e degradação

  • Endocitose

  • Fosfotirosina fosfatase

Função das PTPs com Domínio SH2 na Sinalização de RTKs

• PTPs (fosfotirosina fosfatases) autoinibem-se por ligação intramolecular

• São ativadas por fosforilação em Ser/Thr C-terminal (PKA ou PKC)

• Ligam-se a p-Tyr através de domínios SH2

• Fosfatase ativadas por fosforilação, dissociação dos dominios SH2

• Desfosforilam e inibem tirosina cinases e proteínas efetoras

• Função como supressores tumorais - mutações destas levam a uma ativação persistente desta via

• Recetor desfoforila o recetor e as proteinas efetoras porque são todas em fosforiladas em tirosinas

Desfosforilação da PKB/AKT

Desfosforilada pela PDK1

Fosforilação em serina trionina - tem de ser desfosforiladas para desativação

Fosfatases da familia serina trionina: PP1 e PP2

• desfosforilam serinas trioninas

Estrutura de PP1 e PP2

• PP1: formada por uma subunidade catalítica e uma subunidade reguladora R (R1, R2, R3)

• dimerica

• R1 -modelam atividade, inibem a fosfatase

• r2 - liam à subunidade catalita e substrato, recrutam o substrato para a subunidade catalitiva

• r3 - é a mesma da reguladora e catalitica??

Estrutura e Regulação do PP2A

• Tipo: Proteína trimérica com subunidades C e A, reguladas por fosforilação e metilação.

• Estrutura:

  • Trímerica, composta por uma subunidade catalítica e duas subunidades reguladoras.

  • O dímero formado pela subunidade C e A é um core funcional.

  • A subunidade B possui várias subfamílias e muitas isoformas.

• Regulação: Ocorre a nível da fosforilação ou metilação da subunidade catalítica.

• Função da Subunidade B: Importante para regular aspectos como especificidade e localização subcelular, permitindo a recrutação do core para diferentes locais da célula.

• Complexidade: Podem existir muitos complexos diferentes, permitindo a regulação de múltiplos aspectos na célula. Existem muitas mais famílias de cinases nas células do que fosfatases.

• Relevância Tumoral:

  • Mutações de supressores tumorais estão associados à perda de função.

  • Compostos como ácido ocadáico que inibem PP2A e PP1 promovem tumores.

Substratos do PKB/Akt

• Promoção da Proliferação Celular: Alvos da PKB incluem vias que favorecem a proliferação celular e a sobrevivência.

• Inibição da Apoptose:

  • A PKB está envolvida na inibição de processos apoptóticos

  • A desregulação desta via é frequentemente observada em contextos cancerígenos.

Diferentes Alvos da PKB

• Regulação da BAD e Caspase9 Envolvidas na Apoptose: BAD e Caspase9, que são regulados pela PKB.

• Regulação Transcripcional: A PKB pode aumentar a expressão de proteínas antiapoptóticas, contribuindo para a sobrevivência celular e a resistência à morte celular programada.

Via Mitocondrial da Apoptose

• Envolve sinalização de estresse em danos ao DNA e formação do apoptossoma.

• O evento associado é a permeabilização da membrana mitocondrial e a liberação do citocromo C.

• O citocromo C interage com proteínas como Apaf-1 e caspase-9, formando um complexo conhecido como apoptossoma que ativa caspases, que levam à morte celular.

• Ativação ocorre por dimerização da caspase-9.

• A caspase-9, uma vez ativada, ativa outras caspases, como caspase-3 e caspase-7, que executam a morte celular.

• Essas caspases estão inicialmente na forma inativa e, através de proteólise, são ativadas, degradando proteínas de maneira "indiscriminada", resultando em morte celular.

• Para verificar esta via, utiliza-se anticorpos contra a caspase-3; durante a ativação, observa-se a banda correspondente à caspase ativa, enquanto a outra parte da caspase aparece como uma banda separada.

Proteínas envolvidas no controlo do processo de Apoptose

- BCL2 -

• Pró-apotetótica e Anti-apopetitica

• BCL2, BCLXL

• Pró-apopetóticas: Bad, Bax: promovem formação de canais na membrana que levam à saída de citocromo C

• BCL2 inibem os canais da saída do citocromo C

Regulação do Fator de Transcrição NF-kB

Alvos da PKB e Proteínas Pró-apoptóticas

• BAD:

  • Fosforilada e inativada pela PKB, impedindo a formação dos canais que libertam citocromo C.

  • Fosforilação ocorre em resíduos de serina e treonina; a inativação é mediada por proteínas 14-3-3.

• Caspase 9:

  • Também regulada pela PKB (indiretamente), afetando a apoptose.

• Controlos Transcripcionais:

• NF-kB e CREB: Promovem a expressão de proteínas antiapoptóticas, como CIAP e BCL2.

  • BCL2: Inibe a formação de canais de permeabilização da membrana mitocondrial.

  • CIAP: Proteína inibidora da apoptose celular (Cell Inhibitor of Apoptosis Protein).

Regulação de NF-kB:

• Formada por subunidades p50 e p65, mantida na forma inativa por IKB (Inhibitor of kappa B), que é regulada pela fosforilação.

• Após fosforilação, IKB é degradada, libertando NF-kB.

• Fosforilação do IKB:

• Mediada pela PKB.

• Vias Anabólicas:

• Estimulam a síntese de moléculas, promovendo o crescimento celular e a sobrevivência.

Vias de sinalização: Insulina

São ativadas vias anabolicas para sintese de moleculas para a manter viva

• TOR (Target of Rapamycin): É uma cinase de serina/trionina altamente conservada que desempenha um papel crucial na regulação do crescimento celular. è associada aos lissosomas e não é ativada diretamente pelos PKBs.

• Complexos mTOR: A proteína TOR está presente em dois complexos principais: mTORC1 e mTORC2.

• Ativação do mTOR:

  • Não é ativado diretamente pela PKB, mas sua ativação ocorre através de sinalização mediada por receptores de tirosina cinase (RTKs) e pela presença de aminoácidos.

  • A rapamicina, um inibidor produzido por microrganismos do grupo Streptomycetes, afeta diretamente a via do mTOR.

• Alvos da mTOR:

  • 4E-BP: Esta proteína está envolvida em fatores de iniciação da tradução. Quando a mTOR é ativada, ela fosforila a 4E-BP, resultando na libertação do fator de iniciação de tradução e promovendo a via anabólica da tradução.

• Inatividade e Regulação:

  • A sinalização do mTOR é iniciada por um RTK e é regulada por concentração de aminoácidos.

  • mTOC ativa a sintese proteica, e é inibida com a interação com aminoácidos específicos

  • Vias altamente conservadas

  • responde a fatores de crescimento, ao estado energético da célula e estress

• Ativação de processos anabólicos e inibição dos catabólicos

• TOR no geral estimula processos anabólicos por síntese e biogénese de ribossomas e influencia o metabolismo mitocondrial

• processos cataliticos, como autofagia e degradação de mRNA

mTORC1

• Sensível à rapamicina e formada por várias unidades: deptor, PRAS40, raptor, mLST8, mTOR e TTI1-TEL2

• ativa a síntese de proteinas via fosforilação de S6K e 4E-BP1

• Inibe autofagia

Rapamicina:

• Inibe apenas o complexo 1

• Descoberto em bactérias na ilha da pascoa

• Inibidor do TOR e do crescimento, uma via que em situações de cancro pode estar aumentada

Mecanismos:

PKB: fosforila as GAPs TSC1 e TSC2 (são GAPs para a Rheb)

Rheb (Proteína G): ativa a síntese o TOR

O TOR, uma vez ativado, inibe a autofagia e promove a síntese de proteínas.

• Rheb (Proteina G) ativa a síntese de proteínas

• O que ativa o TOR - Rheb - proteina G

• TSC1 e 2 são GAPs para a Rheb

• PKB fosforila a GAP TSC1/2 quando isso acontecese a Rheb gtp aumenta e a Tor é ativada - inibe a autofagia e promove a sintese de proteinas

• s6k1 também promove a síntese e é ativada pela PKB (PDK1 esta é uma PKB?)

Página 30: Estrutura do mTORC2

• Insensível à rapamicina, regula Akt/PKB e esqueleto celular

• Associado aos ribossomas

• De uma maneira geral promove vias que estão relacionadas para a proliferação das células nomeadamente a proteína Rho e Ras e PKCalfa

• mTORC2 fosforila e ativa a PKB e indiretamente ativa PKCa

Recetores tirosina cinase, através da fosforilação de IRS, ativa PI3K

PI3K associa-se a ribossomas por uma via ativada por PI3K

O Ribossoma ativa mTORC2

mTORC2 ativa Rho, PKCa e no final Ras

mTORC2 ativa também a PKB por fosforilação

Ras ativa MAPK

PI3K pode ativar uma PKD1 diretamente

PKD1 ativa a PKB

PI3K está envolvida noutra cascata que envolve reações redox

(Proteina SOS que é uma proteina GEF)

Composição Modular de Proteínas Adaptadoras de RTK

• Não têm atividade enzimática

• Permitem ligação entre diferentes proteínas sinalizadoras

• LAT (Linker for Activation of T Cells): Sinalização que envolve receptores em células T e indução de respostas imunológicas.

• Dominios são representados como GRB2.

• Proteínas Shc: Ligação através de PTB (phosphotyrosine-binding) e SH2.

• “P” nos domínios são sequências ricas em prolina, importantes para interação com dominios SH3 como os encontrados na Ras

Shc-Grb2-Sos e ativação da Ras

• Para a ativação da proteína Ras é necessário troca GDP para GTP

• Ras pode ser nesta via ativada pela Sos (logo Sos é um GEF)

• Shc é uma proteina que se liga à tirosina fosforilada do RTK através do domínio PTB

• Uma vez recrutada, a proteina Shc vai ser fosforilada pelo recetor numa tirosina, este é o local de ligação da Grb2

• Dímero Grb2-mSOS liga-se à tirosina fosforilada do Shc pelo dominio SH2 e a mSos fica na proximidade da Ras, contribuindo para a sua ativação

• Segunda via - há uma ligação direta do Grb2 à tirosina fsforilada do RTK

• Grb2-MSos funciona porque Sos em prolinas e a outra tem SH3

Página 34: Papel da Proteína Ras na Transdução de Sinal

• Interação com vias de sinalização downstream

• Cascatas MAPK envolvem sempre 3 cinases:

• MAPKKK é ativada pela Ras que fosforila uma

• MAPKK e esta fosforila a

• MAPK e esta fosforila outras proteínas:

  • Proteinas citosolicas ou de membrana: rápida alteração de atividade das mesmas

  • Proteinas de regulação nucleares de genes: alteração de expressão genética

Regulação da Expressão Gênica pela Insulina via MAP Kinase ERK

• Estimula a transcrição de genes relacionados ao ciclo celular e sobrevivência.

• Via desregulada em diabetes

• Via promove ciclo celular crescimento e sobrevivência, via da ERK

• A Ras ativa a via da ERK

• Recetor tirosina cinase envolve outra proteina adaptadora

• Sos complexo ativa a RAS

• Ras ativa a Raf1 que fosforila a Mek em duplas fosforilações e a Mek fosforila a Eek em dupla também

• A ERK fosforila alvos específicos

• Mutações da Ras levam a ativação constitutiva da Ras, logo a ativação de genes para poliferação celular contínuos