轉錄後修飾與轉譯簡介

  • 轉錄後修飾

    • 課程回顧： 上一堂課討論了剪接 (splicing)，即從初級 mRNA 中去除內含子 (introns)。內含子並不包含遺傳資訊，並非最終蛋白質的一部分。

    • mRNA 的保護 (僅限真核生物)： 真核細胞的 mRNA 需要保護以延長其半衰期並確保正確翻譯。

    • 5' 帽 (5' cap) / 7-甲基鳥苷帽 (7-methylguanosine cap)：

      • 位於 mRNA 的 5' 端，是一種獨特的 5'-5' 三磷酸鍵結 (non-canonical phosphodiester bond)。

      • 鳥苷 (Guanosine) 在氮原子 N7N_7 位置被甲基化。

      • 有時，mRNA 前兩個核苷酸的 2'-OH 基團也會被甲基化。

      • 功能：

      • 保護免受降解： 遮蔽 5' 端，防止 5' 到 3' 的核酸外切酶降解 mRNA。mRNA 在細胞中通常需要數小時的壽命。

      • 啟動轉譯： 對於真核生物中核糖體與 mRNA 的結合至關重要 (原核生物使用 Shine-Dalgarno 序列)。

      • 5' 帽形成機制：

      1. 磷酸水解 (Phosphohydrolysis)： 由磷酸水解酶 (phosphohydrolase) 從新合成 RNA 的 5' 端三磷酸中移除一個 gammagamma-磷酸，形成二磷酸 (diphosphate) 5' 端。

      2. 鳥苷轉移酶 (Guanylyltransferase) 作用： 鳥苷轉移酶利用 GTP。mRNA 5' 端的 β\beta-磷酸攻擊 GTP 的 β\beta-磷酸 (alpha-phosphate)。

      3. 焦磷酸 (Pyrophosphate) 裂解： 釋放一個焦磷酸 (PPiPP_i)。

      4. 5'-5' 三磷酸鍵結形成： 形成一個 5'-5' 的三磷酸鍵，將鳥苷連接到 mRNA 上。 (注意：初始 mRNA 有 3 個磷酸，1 個被移除。GTP 提供 3 個磷酸，2 個作為 PPiPP_i 被移除。總體而言，在這些步驟中移除了 3 個磷酸)。

      5. 甲基化： 鳥苷 7-甲基轉移酶 (Guanine 7-methyltransferase) 利用 S-腺苷甲硫氨酸 (S-adenosylmethionine, SAM) 作為甲基供體，將一個甲基基團添加到鳥苷的 N7N_7 位置，SAM 轉化為 S-腺苷同型半胱氨酸 (S-adenosylhomocysteine)。

      6. 額外甲基化 (可選)： 2'-OH 甲基轉移酶 (2'-OH methyltransferases) 可甲基化前一兩個核苷酸的 2'-OH 基團。

    • 3' 聚腺苷酸尾 (3' poly-A tail)：

      • 位於 mRNA 的 3' 端。

      • 機制：

      1. 裂解訊號： 在 mRNA 的終止密碼子之後，一個高度保守的序列 (AAUAAA) 作為裂解訊號。

      2. 核酸內切酶裂解： 一個包含聚腺苷酸聚合酶 (poly-A polymerase) 和核酸內切酶的複合體，在 AAUAAA 序列下游約 20 個核苷酸處裂解 mRNA。

      3. 聚腺苷酸聚合酶作用： 聚腺苷酸聚合酶結合到裂解後的 3' 端。這種酶不需要模板。

      4. 腺苷酸的添加： 它將 50-200 個腺苷核糖核苷酸添加到 3' 端，每次添加都釋放一個焦磷酸 (PPiPP_i)。

      • 功能：

      • 保護免受降解： 聚腺苷酸尾越長，mRNA 的壽命和穩定性就越長。核酸外切酶首先降解聚腺苷酸尾，從而延緩編碼序列的降解。

    • mRNA 的整體轉錄後成熟 (以卵清蛋白基因為例)：

    • DNA (約 77007700 bp) -> 初級轉錄本 (pre-mRNA)，包含外顯子 (exons) 和內含子 (introns)。

    • 添加 5' 帽。

    • 切除聚腺苷酸化訊號之後的額外 RNA。

    • 剪接：移除內含子。

    • 添加聚腺苷酸尾。

    • 成熟 mRNA：例如，從約 77007700 bp 減少到 18721872 個核苷酸 (約為初級轉錄本的 20%20 \%)，包含 7 個外顯子。

    • 大多數 mRNA 都會經歷這些修飾。少數 mRNA 可能缺乏聚腺苷酸尾或內含子 (在動物細胞的 2000020000 種 mRNA 中佔少數)。

    • 核糖體 RNA (rRNA) 的加工：

    • 真核 RNA 聚合酶 I 合成一個單一的 45S45S 初級 rRNA 轉錄本 (pre-rRNA)。

    • 這個 45S45S pre-rRNA 包含 18S18S、5.8S5.8S 和 28S28S rRNA 序列，並夾雜著非功能性的間隔區 (spacer regions)。

    • 修飾： 在 18S18S、5.8S5.8S 和 28S28S 區域中，大約每 100100 個鹼基就有一個鹼基的 2'-OH 基團被甲基化。這有助於防止 RNA 的自我降解。

    • 裂解： 間隔區被核酸內切酶裂解移除，產生成熟的 18S18S、5.8S5.8S 和 28S28S rRNA。

    • mRNA 降解：

    • 半衰期：

      • 細菌：11 至 22 分鐘 (為快速響應代謝需求變化，例如乳糖操縱子；合成速度快，約 5050 核苷酸/秒，蛋白質約 2020 胺基酸/秒)。

      • 真核生物：約 33 小時 (較慢的細胞過程，主要在轉譯層級進行調控)。

    • 降解酶： 核糖核酸酶 (Ribonucleases, RNases)。主要為 5' 到 3' 的核酸外切酶 (exonucleases)，但也有 3' 到 5' 的核糖核酸酶。

    • 真核生物中的機制：

      1. 聚腺苷酸尾縮短： 聚腺苷酸尾逐步縮短。

      2. 5' 帽移除： 5' 帽被移除。

      3. 5' 到 3' 降解： mRNA 隨後從 5' 端到 3' 端被降解。

    • 細菌中的機制： 由於細胞循環速度快，為了回收構建塊，降解甚至可以在轉錄完成之前從 5' 端開始。

  • 轉譯簡介

    • 課程定位： 涵蓋了核苷酸、RNA/DNA 的一般知識、複製 (replication) 和轉錄 (transcription)。本部分開始轉譯 (translation)。之後將討論基因表達調控、基因工程和荷爾蒙。

    • 轉譯的涵蓋主題：

    1. tRNA (轉移 RNA) 結構。

    2. 擺動假說 (Wobble hypothesis)。

    3. 密碼子 (Codons) 和反密碼子 (Anticodons)。

    4. 下節課：轉譯過程 (啟動、延伸、終止，以及細胞為此過程消耗的能量)。

    • tRNA (轉移 RNA)：

    • 轉錄後修飾： 從較長的初級轉錄本中剪切而成 (類似 rRNA)。

    • 3' 末端： 特徵性的 CCA 序列。胺基酸接合在 3' 末端的腺苷 (A) 上。

    • 修飾鹼基 (Modified bases)： 許多鹼基被修飾 (例如，甲基化、脫氨基、還原)。

      • 核糖胸苷 (Ribothymidine, T)： 含有連接到胸腺嘧啶 (thymine) 的核糖糖 (非去氧核糖)。在 RNA 中不常見，但存在於 tRNA 中。見於 TΨ\PsiC 臂。

      • 假尿苷 (Pseudouridine, Ψ\Psi)： 尿嘧啶鹼基，但與核糖的醣苷鍵是透過碳原子 (C) 而非氮原子 (N) 鍵結。見於 TΨ\PsiC 臂。

      • 二氫尿苷 (Dihydrouridine, D)： 尿苷的還原型 (無雙鍵)，含有兩個額外的氫原子。見於 D 臂。

    • 結構：

      • 單鏈分子，類似 mRNA 和 rRNA。

      • 是最小的 RNA 之一 (長度介於 7373 到 9393 個鹼基)，直到 microRNA 被發現。

      • 具有高度特化的三維結構。

      • 理論上可能有 6464 種密碼子，但只有 6161 種編碼胺基酸 (33 種是終止密碼子)。因此，理論上需要 6161 種不同的 tRNA 來編碼胺基酸。

      • 5' 端通常是鳥苷 (G)。

      • 三葉草 (cloverleaf) 二級結構： 一種二維表示，具有 4 個主要臂 (有時還有一個功能上較不重要的第 5 個“額外臂”)。

      1. 胺基酸臂 (acceptor stem)： 位於 3' 端，攜帶胺基酸 (CCA 序列)。對胺醯-tRNA 合成酶 (aminoacyl-tRNA synthetases) 將正確的胺基酸連接到 tRNA 上至關重要。

      2. 反密碼子臂 (anticodon arm)： 包含識別 mRNA 密碼子的反密碼子 (3 個鹼基)。反密碼子以 5' 到 3' 的方向讀取。此環通常包含圍繞反密碼子的 77 個核苷酸。

      3. D 臂 (Dihydrouridine arm)： 包含二氫尿苷。

      4. TΨ\PsiC 臂 (T-pseudouridine-C arm)： 包含核糖胸苷 (T) 和假尿苷 (Ψ\Psi)。

      5. 額外臂 (Extra arm)： 長度可變，有時不存在。對基本結構的重要性最低。

      • 扭曲的 L 形三級結構： D 臂和 TΨ\PsiC 臂相互作用形成這種 L 形結構。這種三維結構對於 tRNA 的功能至關重要，可確保：

      • 胺基酸連接位點和反密碼子之間有明確的空間分離。

      • 胺基酸特異性識別 mRNA 密碼子。

      • L 形結構將反密碼子環定位在遠離胺基酸連接位點的位置，使其能夠與核糖體和 mRNA 相互作用。

      • 三維結構確保反密碼子環中只有 33 個鹼基可供配對。其他鹼基要麼在結構上不可接近 (例如，特定位置的嘧啶)，要麼經過修飾以防止鹼基配對 (例如，修飾阻止氫鍵形成的嘌呤)。這種剛性結構可防止錯誤配對。

    • 密碼子與反密碼子：

    • 密碼子表： (僅供參考，無需背誦)。

    • 起始密碼子 (Start codon)： AUG (甲硫胺酸, Met) – 總是以第一個 AUG 定義轉譯的起始。此處的突變可能導致截短或延長的蛋白質。

    • 終止密碼子 (Stop codons)： UAA、UAG、UGA (不編碼任何胺基酸，也沒有對應的 tRNA)。

    • 密碼子： 位於 mRNA 上，以 5' 到 3' 的方向讀取。

    • 反密碼子： 位於 tRNA 上，與 mRNA 密碼子互補，也以 5' 到 3' 的方向讀取。絕對不能混淆。例如：mRNA 密碼子 AUC (異亮胺酸)。tRNA 反密碼子 GAU (5' 到 3') 與其配對 (G 與 C，A 與 U，U 與 A)。如果識別錯誤，將會摻入錯誤的胺基酸 (例如，天門冬胺酸而非異亮胺酸)。

    • 開放閱讀框 (Reading Frame)：

      • 每個密碼子為 3 個鹼基組。

      • 一條 mRNA 具有 3 種可能的閱讀框。

      • 僅僅一個核苷酸的位移 (移碼突變) 就會嚴重改變蛋白質序列。這突顯了精確剪接的重要性。

      • 在研究中，通常選擇起始密碼子和終止密碼子之間最長的一個開放閱讀框 (ORF)。

      • 遇到的第一個 AUG 總是起始密碼子。

    • 遺傳密碼的簡併性 (Degeneracy of the Genetic Code)：

    • 含義： 多個密碼子可以編碼同一種胺基酸 (例如，精胺酸有 6 個密碼子：CGU、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG)。

    • 特異性： 一個密碼子總是只編碼一種特定的胺基酸 (例如，AUG 總是編碼甲硫胺酸)。

    • 非簡併 (Non-degenerate)： 甲硫胺酸 (AUG) 和色胺酸 (UGG) 是獨特的，每個只有一個密碼子。

    • 突變的影響：

      • 沉默突變 (Silent mutations)： 密碼子第三個位置的鹼基改變可能仍編碼相同的胺基酸 (例如，CGU、CGC、CGA、CGG 都編碼精胺酸)。這通常由於簡併性和擺動假說而可能發生。

      • 錯義突變 (Missense mutations)： 鹼基改變導致不同的胺基酸。

      • 範例：蘇胺酸 (Threonine, ACC) 變為異亮胺酸 (Isoleucine, AUC)。蘇胺酸有 OH 基團 (極性，不帶電荷)，異亮胺酸是非極性的。這種差異可能顯著改變蛋白質結構和功能 (例如，活性位點)。

      • 範例：亮胺酸 (Leucine, CUA) 變為絲胺酸 (Serine, UCA)。非極性亮胺酸變為極性絲胺酸。

      • 範例：亮胺酸 (Leucine, CUC) 變為脯胺酸 (Proline, CCU)。脯胺酸是一種螺旋斷裂者 (helix-breaker)，會嚴重影響二級結構。

      • 這些結構變化可能對蛋白質功能產生深遠影響。

    • 擺動假說 (Wobble Hypothesis)：

    • 背景： 為了優化效率，細胞不需要 6161 種不同的 tRNA 來識別 6161 個編碼密碼子。可以實現減少。

    • 次黃嘌呤核苷 (Inosine, I)： tRNA 中的一種修飾鹼基，由腺苷 (Adenosine) 經脫氨基作用產生。次黃嘌呤 (Hypoxanthine) 是鹼基，次黃嘌呤核苷是核苷。它是一種含有酮基的嘌呤。

    • 原理：

      1. mRNA 密碼子的前兩個鹼基與 tRNA 反密碼子的後兩個鹼基 (分別是第 3 和第 2 個位置) 形成強鹼基配對。這對特異性至關重要。

      2. tRNA 反密碼子的第一個鹼基 (5' 端，即“擺動位置”) 有時可以與 mRNA 密碼子第三個位置的多個鹼基配對。這允許單個 tRNA 識別多個密碼子。

    • 擺動配對規則 (tRNA 反密碼子第一個鹼基與 mRNA 密碼子第三個鹼基)：

      • C (反密碼子) -> G (密碼子) (1 對 1 配對)

      • A (反密碼子) -> U (密碼子) (1 對 1 配對)

      • U (反密碼子) -> A 或 G (密碼子) (1 對 2 配對，U 可以識別 A 或 G)

      • G (反密碼子) -> C 或 U (密碼子) (1 對 2 配對，G 可以識別 C 或 U)

      • I (次黃嘌呤核苷, 反密碼子) -> A、U 或 C (密碼子) (1 對 3 配對，I 可以識別 A、U 或 C)

    • 效率： 由於擺動假說，只需大約 3232 種 tRNA 就可以識別所有 6161 種編碼胺基酸的密碼子，而不是 6161 種 tRNA。這使得所需 tRNA 的數量減少了近 50%50 \%。

    • 擺動配對範例：

      • 反密碼子中的鳥嘌呤 (G) 可以與密碼子中的尿嘧啶 (U) 形成兩個氫鍵 (而非與胞嘧啶形成三個氫鍵)。

      • 反密碼子中的尿嘧啶 (U) 可以與密碼子中的鳥嘌呤 (G) 形成兩個氫鍵。

    • 丙胺酸 (Alanine) 範例： 密碼子為 GCU、GCC、GCA。無需 33 種各自的反密碼子為 CGA、CGG、CGU 的 tRNA，由於次黃嘌呤核苷在擺動位置能夠與 U、C 或 A 配對，一個帶有反密碼子 IGC (次黃嘌呤核苷-鳥嘌呤-胞嘧啶) 的單一 tRNA 即可識別這三個密碼子。這仍確保只有丙胺酸被摻入蛋白質中。

    • 擺動位置的氫鍵： 雖然 G-C 和 A-U 分別是強力的 3 條和 2 條氫鍵配對，但像 G-U 這樣的擺動配對也能形成 2 條氫鍵，仍然允許相互作用，儘管強度略弱。