Biologia Molecolare della Cellula - Processamento dell’RNA e Codice Genetico
Biologia Molecolare della Cellula #7 - Processamento dell'RNA e Codice Genetico
Dogma Centrale della Biologia Molecolare
Il dogma centrale della biologia molecolare descrive il flusso di informazione genetica:
DNA viene trascritto in RNA.
RNA viene tradotto in proteine.
Eucarioti vs. Procarioti
Differenze Cellulari Principali:
Eucarioti: Presenza di nucleo e organelli.
Procarioti: Assenza di nucleo e organelli.
Differenze a Livello del Genoma:
DNA Batterico: Quasi totalmente codificante (si traduce in proteine).
DNA Eucariotico: Più del 97% non codifica per proteine.
Replicazione: Origini di replicazione multiple negli eucarioti.
Istoni: Assenti nei batteri, presenti in eucarioti e archea.
Compartimentazione:
Procarioti: Trascrizione e traduzione nello stesso compartimento.
Eucarioti: Trascrizione nel nucleo, traduzione nel citosol.
Trascritto:
Procarioti: Policistronico (un trascritto codifica per più proteine).
Eucarioti: Monocistronico (un trascritto codifica una proteina).
Geni Eucariotici: Divisi in introni (non codificanti) ed esoni (codificanti).
mRNA Eucariotico: Processato ed esportato dal nucleo al citosol.
Processamento dell'RNA negli Eucarioti
Avviene nel nucleo e include tre fasi principali:
Capping
Splicing
Poliadenilazione
L'intera sequenza dell'mRNA eucariotico viene processata:
Capping in 5'.
Splicing degli introni.
Aggiunta di poli-A in 3'.
Significato Evolutivo: Permette maggiore complessità e precisione attraverso compartimenti cellulari specifici e meccanismi di controllo genomico.
Tutti gli eventi di processamento sono controllati durante la trascrizione (co-trascrizionale).
RNA polimerasi II: Responsabile dei meccanismi di processamento grazie alla sua lunga coda C-terminale:
Coda C-terminale piena di serine che vengono fosforilate.
La fosforilazione recluta vari fattori che modificano l'mRNA.
Capping
Inizia quando circa 25 nucleotidi sono stati trascritti.
La fosforilazione della coda della polimerasi recluta le proteine che effettuano il capping.
Caratteristiche del Capping:
Aggiunta di una base azotata (guanosina) metilata.
Legame 5'-5': il 5' della guanosina si lega con il 5' dell'mRNA.
Questo legame protegge l'mRNA dalla degradazione da parte delle esonucleasi e facilita il trasporto dal nucleo al citosol.
Funzioni del Capping:
Protegge dalla degradazione.
Facilita il trasporto dell'mRNA nel citosol.
Aiuta la traduzione facilitando il riconoscimento della metionina.
Fasi del Capping:
Fosfatasi: Rimuove il primo gruppo fosfato dal primo nucleotide dell'mRNA.
Guanylyl-transferase: Attacca GMP partendo da GTP con un legame 5'-5'.
Prima metilazione: Aggiunta di un metile sull'azoto 7 della guanosina.
Eventuale seconda metilazione: Aggiunta di un metile all'ossigeno in posizione 2 del ribosio.
Splicing
Differenza tra Procarioti ed Eucarioti:
Procarioti: Trascritto completamente codificante.
Eucarioti: Trascritto iniziale (pre-RNA) contiene introni ed esoni; solo gli esoni saranno presenti nell'RNA maturo.
5' UTR (untranslated region) e 3' UTR non sono codificanti.
5' UTR: Serve per il posizionamento del ribosoma.
3' UTR: Serve per regolare l'emivita dell'mRNA.
Nei mammiferi, circa il 95% dei geni codifica per proteine e ha introni ed esoni.
Evoluzione:
Il numero di introni ed esoni è aumentato durante l'evoluzione tra uomo e lievito.
Lievito: Pochi introni (circa il 96% dei geni non ha introni).
Uomo: Il 94% dei geni ha introni/esoni (alcuni geni ne hanno fino a 60).
La complessità non dipende dal numero di geni, ma dal numero di introni ed esoni.
Gli esoni sono brevi e codificano per 30-50 amminoacidi, mentre gli introni possono essere lunghi fino a 30000 nucleotidi.
Gli esoni sono altamente conservati tra specie diverse, mentre la lunghezza degli introni varia notevolmente.
Questo perché le mutazioni negli introni non hanno pressione selettiva.
Meccanismo dello Splicing:
Avviene grazie a 5 ribonucleoproteine (snRNP), formate da proteine e RNA.
Le snRNP formano lo spliceosoma, che elimina gli introni e unisce gli esoni.
Le snRNP contengono piccoli RNA (small nuclear ribonucleoprotein) chiamati U1, U2, U4, U5, U6.
U3 modifica l'RNA ribosomiale.
Le sequenze di splicing sono poco conservate.
Siti Fondamentali per lo Splicing:
Sito a 5' (donatore di splicing): Alla fine dell'esone 1.
Sito di ramificazione: Contiene un'adenosina di biforcazione (A) al centro dell'introne.
Sito a 3' (accettore di splicing): Circa 20 nucleotidi a valle dell'adenosina di ramificazione, preceduto da un tratto di pirimidine.
Rimozione degli Introni
L'adenosina di ramificazione è fondamentale: si lega a tre basi invece che due, formando un cappio.
Fasi:
U1 si lega al sito 5', BBP (branch-point binding protein) si lega al sito dell'adenosina di ramificazione.
BBP recluta anche U2 sempre sul sito dell'adenosina di ramificazione.
U4, U5, U6 vengono reclutati e interagiscono con U1 e U2, forzando la formazione del cappio.
Rimodellamento: U1 e U4 escono dal complesso, le estremità si avvicinano all'adenosina reattiva, il cappio si stacca e viene degradato nel nucleo.
-OH libero in 3' del primo esone attacca il sito al 5' del secondo esone, unendo i due esoni.
Arriva il 'sigillo di qualità': proteine di EJC (exon junction complex) si legano dove è avvenuta la ricongiunzione degli esoni.
Un trascritto può subire splicing in modo differente (splicing alternativo). Il 90% dei geni subisce splicing alternativo.
In media, una proteina può dare origine a sette trascritti diversi.
Esempio: La tropomiosina ha isoforme diverse ottenute da splicing diversi in base al tessuto (muscolo liscio e muscolo striato).
Lo splicing diverso aumenta la complessità.
Splicing Alternativo e Complessità
L'uomo ha solo 21000 geni, la Drosophila circa 15000 e C. elegans circa 19000.
L'incremento della complessità degli organismi deriva dallo splicing alternativo.
Non cambia il genoma (definito), ma l'esoma (insieme di RNA maturi che arrivano nel citosol).
Lo splicing alternativo aumenta la possibilità di fare proteine in isoforme diverse.
Si pensa che ci siano 150000 trascritti diversi da circa 21000 geni che danno origine a 80000 proteine diverse.
L'evoluzione permette di ricombinare gli esoni e creare diverse proteine.
Curiosità: Nella drosophila, il gene Dscam potrebbe avere fino a 38000 varianti di splicing diverse.
Modifiche dello Splicing Alternativo
Tipi di modifiche:
Exon skipping: Un esone viene saltato perché il macchinario di splicing non riconosce i siti di splicing.
Variazioni nella posizione del sito di splicing al 3' o al 5' dell'introne: Le sequenze esoniche possono risultare accorciate o allungate.
Mantenimento di una sequenza intronica: Un introne non viene tagliato.
Esone alternativo/mutualmente esclusivo: Alcuni siti di splicing impediscono ad altri siti di splicing di essere utilizzati.
Determinazione dello Splicing Alternativo:
RNA-binding proteins (RBPs): Proteine che legano il trascritto e possono agire da enhancers (favoriscono lo splicing) o silencers (bloccano lo splicing).
A seconda se si legano negli esoni o negli introni, avremo splicing esonici o intronici.
Proteine Famose:
Exonic splicing enhancers (ESEs)
Intronic splicing enhancers (ISEs)
Exonic splicing silencers (ESSs)
Intronic splicing silencers (ISSs)
Le SR (serine rich protein) legano e marcano la presenza di un esone, favorendo lo splicing.
Modulando la presenza di queste proteine SR nei vari tessuti si forma lo splicing alternativo.
Errori/Mutazioni degli Introni
Le mutazioni degli introni non sono selezionate dalla pressione evolutiva, ma si pensa che il 10% delle malattie genetiche siano dovute a una mutazione degli introni.
Mutazioni Problematiche:
Distruzione di un sito importante (sito di ramificazione, sito in 3' e sito in 5').
Generazione di un sito nuovo.
Alcune mutazioni sono patologiche, come nei pazienti con la beta talassemia.
Prevenzione degli Errori:
Lo splicing è co-trascrizionale: l'RNA polimerasi capisce che è finito l'introne grazie al sito in 3' che indica che può staccare il cappio.
Poliadenilazione
Avviene al 3'.
Due proteine multisubunità, CstF (fattore di stimolazione del taglio F) e CPSF (fattore di specificità del taglio e della poliadenilazione), si legano a sequenze specifiche.
Sequenza AAUAAA: Si lega alla proteina CPSF.
Sequenza ricca di GU: Si lega alla proteina CstF.
Dopo il taglio, la poliA-polimerasi aggiunge all'estremità 3' una A alla volta fino circa a 200 A.
La poliadenilazione frena l'intervento nel citosol delle esonucleasi che degraderebbero l'RNA.
La lunghezza della coda di poli A determina la sopravvivenza dell'mRNA nel citosol.
La coda di poli A viene coperta da Poly A binding protein.
Siti di Poliadenilazione Alternativi
Circa il 50% dei geni hanno siti di poliadenilazione alternativi.
Esempio: Anticorpi:
Assenza di infezioni: I linfociti B hanno sulla loro superficie una immunoglobulina con un C-terminale altamente idrofobico.
Pochi CstF -> Trascrizione prosegue fino a un sito a valle più forte -> Anticorpo rimane attaccato alla membrana.
Attivazione dei linfociti B: Viene indotta la produzione di CstF.
Sito debole viene riconosciuto e il trascritto viene tagliato -> Anticorpo più corto senza amminoacidi idrofobici viene secreto.
Come viene sganciata la poliadenilazione, può portare alla formazione di proteine completamente diverse.
RNA Editing
Un meccanismo poco studiato che avviene nel nucleo.
Si tratta di una modifica rara che non avviene in tutti gli RNA.
In circa mille RNA avviene una sostituzione delle basi in base al tessuto, garantendo la variabilità da degli enzimi chiamati ADAR.
Se si rimuovono questi enzimi, alcuni animali (es. topi) non editano correttamente un canale per il calcio, causando epilessia.
Introdurre mutazioni nell'RNA potrebbe essere sfruttato dai virus a RNA per mutare e sfuggire ai vaccini.
Motivo della Modifica dell’RNA: L'mRNA viene modificato per evitare la sua degradazione da parte dell'esosoma (