Praktické cvičenie č. 4: Všeobecná bakteriológia – Kultivácia baktérií

4. Všeobecná bakteriológia

Anotácia

  • Účel praktického cvičenia: kultivácia baktérií, metódy kultivácie baktérií a hodnotenie rastu baktérií na kultivačných pôdach.

Kultivačné pôdy - rozdelenie

Podľa pôvodu

  • Prírodné: Obsahujú zložky živočíšneho a rastlinného pôvodu.

  • Syntetické: Obsahujú chemicky definované zlúčeniny.

  • Polosyntetické: Popri definovaných chemických látkach obsahujú aj prirodzené zložky.

Príklady zložiek kultivačných pôd

  • Sacharóza: 10.0 g, funkcia: zdroj uhlíka C a energie.

  • K2HPO4: 2.5 g, funkcia: pH tlmivý roztok, zdroj P a K.

  • KH2PO4: 2.5 g, funkcia: pH tlmivý roztok, zdroj P a K.

  • (NH4)2HPO4: 1.0 g, funkcia: pH tlmivý roztok, zdroj P a N.

  • MgSO4·7H2O: 0.20 g, funkcia: zdroj S a Mg2+.

  • FeSO4·7H2O: 0.01 g, funkcia: zdroj Fe2+.

  • MnSO4·7H2O: 0.007 g, funkcia: zdroj Mn2+.

  • Voda: 985 ml, pH 7.0.

    • Syntetické chemicky definované médium pre kultiváciu Bacillus megaterium.

Podľa konzistencie

  • Tekuté: Bujón.

  • Pevné: Tuhé, s použitím agaru v koncentrácii 2.5 - 10 %.

  • Polotuhé: Agar, želatína - 1 %.

Podľa použitia

  • Základné - univerzálne.

  • Transportné: Stuartovo, Amies médium.

  • Pomnožovacie: Bujón, selenit + pečeň.

  • Diagnostické: Skvasovanie cukrov, tvorba hemolyzínov.

  • Selektívne: NaCl, žlč, farbivo.

Podmienky kultivácie baktérií

  • Výber vhodnej kultivačnej pôdy: zabezpečenie dostatku živín, rastových faktorov, vitamínov a pod.

  • Dostatočná vlhkosť.

  • Optimálne pH: 7,2 - 7,3.

  • Optimálna teplota kultivácie: 37°C.

    • Mezofilné (25 - 37°C).

    • Psychrofilné (4 - 20°C).

    • Termofilné (40 - 55°C).

  • Plynné prostredie:

    • Aeróbne: vyžaduje O2.

    • Mikroaerofilné: 5-10% CO2.

    • Anaeróbne: kultivácia trvá 2 - 5 dní.

  • Dĺžka kultivácie: 24 - 48 hodín pre anaeróbne mikroorganizmy, 2 - 5 dní pre Mycobacterium tuberculosis (3 - 9 týždňov).

Vzťah baktérií ku kyslíku

  • Typy dýchania:

    • Obligátne aeróby: Vyžadujú O2 na rast.

    • Fakultatívne anaeróby: Môžu rásť s O2 alebo bez neho.

    • Aerotolerantné anaeróby: Nepotrebujú O2, ale môžu ho tolerovať.

    • Striktné anaeróby: Zomrú v prítomnosti O2.

    • Mikroaerofily: Vyžadujú nižšie koncentrácie O2.

Enzýmy

  • Takmer všetky typy baktérií majú rôzne enzýmy na rozklad superoxidu, peroxide, atď.

    • Napríklad,: Superoxíd dismutáza (SOD), kataláza.

Rast baktérií

V tekutej tioglykolátovej pôde

  • Hodnotenie rastu mikroorganizmov:

    • Zákal, sediment, blanka (homogénny, vločkový, zrnitý).

Na tuhých kultivačných pôdach

  • Hodnotenie:

    • Veľkosť kolónie (v mm).

    • Tvar: plochý, vypuklý, hviezdicovitý.

    • Okraj: rovný, laločnatý, plsťovitý.

    • Povrch: hladký, drsný, lesklý, matný.

    • Konzistencia: mazľavá, drobivá, hlienovitá.

    • Transparencia: priehľadná / nepriehľadná.

    • Farba: bezfarebná, šedá, biela, žltá, atď.

    • Zápach: fekaloidný, čpavkový, hnilobný, jazmínový.

Zmeny pôdy v okolí kolónií

  • Sfarbenie: môže naznačovať produkciu metabolitov.

  • Redukcia kovov: môže byť známkou kyselinotvorných baktérií.

  • Hemolýza:

    • Alfa-hemolýza (viridácia).

    • Beta-hemolýza.

Typy hemolýzy na krvnom agare

  • Gamma hemolýza: žiadna hemolýza (napr. Staphylococcus epidermidis).

Praktické úlohy

  1. Sledujte vplyv zloženia kultivačných médií na rast mikroorganizmov: Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus na Lewinthalovej pôde, krvnom agare a Endovej pôde.

  2. Porovnajte pH sterilného živného bujónu a bujónu naočkovaného kultúrou Escherichia coli a vysvetlite výsledok.

  3. Vyhodnoťte rast baktérií v tekutých a na pevných kultivačných pôdach: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus salivarius, Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Proteus mirabilis.

  4. Sledujte rast mikroorganizmov v tekutej pôde: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus salivarius.

  5. Vyhodnoťte test produkcie pigmentov P a F na agare s Pseudomonas aeruginosa.

  6. Izolujte čistú kultúru baktérií z primokultivácie na pevnej pôde.

Demonštrácie

  1. Nenaočkované kultivačné médiá:

    • Agarové pôdy: Krvný agar, Čokoládový agar, Lewinthalova pôda, Endova pôda, dezoxycholátová pôda, Wilson-Blairova pôda (bizmutsulfitová pôda), VL agar, Schaedlerov agar.

    • Tekuté pôdy: živný bujón, tioglykolátová pôda, selenitová pôda, alkalická peptónová voda.

  2. Rast baktérií na chromogénnych médiách.

  3. Rast Mycobacterium tuberculosis na Löwenstein-Jensenovej pôde.

Anaeróbna kultivácia

  • Produkcia váku: ventilácia pre anaerobiku.

  • Náhrada kyslíka: inými plynmi.

  • Absorpcia kyslíka: chemickými a biologickými postupmi.

  • Vytvorenie redukčného prostredia.

Pomôcky na anaeróbnu a mikroaerofilnú kultiváciu

  • Catalyst chamber: Obsahuje palladium granule.

  • Gas generator envelope: Voda sa pridáva k chemikáliám v obálke, aby sa vytvoril H₂ a CO₂.

    • Dôležité: CO₂ podporuje rýchlejší rast mikroorganizmov.

  • Anaerobic indicator strip: Methylene blue sa stáva bezfarebným v neprítomnosti O2.