Notes de Cours : Initiation aux Techniques Usuelles de Biologie Moléculaire

Initiation aux Techniques Usuelles de Biologie Moléculaire

• Introduction au cours (M26) : Ce module est dispensé à la Faculté des Sciences de Rabat (Université Mohammed V) pour le semestre 4 (2024/2025) par le Pr. Leila Medraoui.

• Objectif global : Décrire les gestes et principes fondamentaux permettant l'étude des acides nucléiques, de leur extraction à leur amplification.

• Plan du cours :

  • I.1 : Réplication et transcription (Procaryotes et Eucaryotes).

  • I.2 : Traduction.

  • I.3 : Initiation aux techniques usuelles de biologie moléculaire.

  • II : Le Dogme Central.

  • III : Régulation génétique chez les bactéries.

Méthodes d’étude des Acides Nucléiques : Extraction et Purification

• Objectifs pédagogiques :

  • Décrire les étapes de l'extraction et de la purification de l'ADN génomique.

  • Différencier les démarches selon le type d'organisme.

  • Expliquer l'extraction de l'ARN messager (ARNm) pour la création de banques d'ADNc.

  • Maîtriser le dosage spectrophotométrique et le calcul des quantités à partir des données brutes.

• Diversité des sources d'ADN :

  • ADN génomique : Totalité de l'ADN nucléaire ou chromosomique.

  • Autres types : ADN mitochondrial, ADN chloroplastique, et ADN extra-chromosomique (plasmides).

• Principe général de l'extraction : Technique permettant d'isoler l'ADN pour des utilisations ultérieures telles que la digestion, le Southern blot, le séquençage, la PCR ou le clonage. Le schéma de principe comporte :

  • Lyse des cellules.

  • Élimination des protéines.

  • Élimination des autres acides nucléiques (ARN).

  • Concentration par précipitation à l'alcool.

• Variantes techniques :

  • L'ADN peut provenir de tissus (animaux/végétaux) ou de cellules (micro-organismes, fluides).

  • Méthode organique : Utilisation de Phénol-Chloroforme.

  • Kits commerciaux : Colonnes de silice ou billes magnétiques.

• Composition de la solution de lyse et rôles des agents :

  • Tampon : Maintient le pH, sans pression osmotique pour faire éclater les membranes.

  • EDTA (Acide éthylène diamine tétra-acétique) : Inhibe les nucléases en chélatant les ions $Mg^{2+}$ et $Ca^{2+}$.

  • SDS (Lauryl-sulfate de Sodium) : Détergent qui dénature les lipoprotéines membranaires et les enzymes lysosomiales, libérant l'ADN tout en préservant sa structure.

  • Protéinase K : Enzyme ajoutée pour l'homogénéisation et la déprotéinisation.

• Extraction organique (Phénol/Chloroforme) :

  • Phénol distillé (saturé Tris) : Agent déprotéinisant puissant. Après agitation et centrifugation à $10000\,g$ pendant $10\,mn$ à $4^\circ C$, les protéines se retrouvent dans la phase organique ou à l'interface.

  • Densités : Le phénol saturé à une densité $d = 1,07$. Le mélange Chloroforme/Alcool Isoamylique (24:1) a une densité $d = 1,45$.

  • Purification finale : Utilisation de dialyse ou chromatographie pour éliminer les traces de phénol.

• Précipitation de l'ADN :

  • L'ajout de NaCl (force ionique élevée, $3\,M$ à $1/10$ du volume) et d'un excès d'éthanol absolu à $-20^\circ C$ précipite l'ADN.

  • Observation : Apparition de la « méduse », un précipité blanchâtre et filamenteux.

  • Lavage : Resuspension dans de l'éthanol à $75\%$ à $-20^\circ C$, suivi d'une centrifugation à $10000\,g$ pendant 15 minutes.

  • Stockage : ADN séché sous vide, conservé à sec ou dissous dans l'eau stérile ou le tampon Tris-EDTA (TE).

Extraction de l'ADN Plasmidique

• Définition des plasmides :

  • Petites molécules d'ADN double brin, généralement circulaires et extra-chromosomiques.

  • Taille : $1\,kb$ à $1\,Mb$.

  • Nombre : Copie unique ($1$ à $3$ par cellule) ou copies multiples ($20$ à $2000$ par cellule).

  • Types de réplication : Stringente (plasmide stringent) ou relâchée (plasmide relâché).

• Formes topologiques de l'ADN plasmidique :

  • Forme I : Circulaire fermée superenroulée (superhélical). C'est la forme la plus compacte.

  • Forme II : Circulaire ouverte (relâchée) suite à une coupure sur un seul brin.

  • Forme Ir : Circulaire fermée après réparation par une ligase.

  • Forme III : Linéaire suite à une coupure sur les deux brins.

• Technique de la Lyse Alcaline :

  1. Lyse avec du SDS en présence de soude ($NaOH$ à $pH\,13$) : Dénaturation de l'ADN total (génomique et plasmidique).

  2. Neutralisation rapide avec de l'acétate de potassium ($pH\,5,5$) : L'ADN plasmidique, petit et circulaire, se renature rapidement. L'ADN chromosomique, trop long, s'enchevêtre et précipite avec les protéines et le SDS.

  3. Centrifugation pour récupérer le surnageant contenant les plasmides.

  4. Traitement par des ribonucléases pour éliminer les ARN.

  5. Précipitation à l'alcool et resuspension dans du TE.

Extraction et Purification de l'ARN

• Principes de l'extraction de l'ARN :

  • Nécessite l'inhibition absolue des ARNases (enzymes dégradant l'ARN).

  • Utilisation du Trizol ($pH\,5$) pour le broyage/homogénéisation.

  • Utilisation possible du DEPC (diéthyl pyrocarbonate) : Composé organique qui inactive les ARNases en réagissant avec les résidus histidine et tyrosine. Après usage, le DEPC est dégradé par chauffage à $120^\circ C$ (autoclave) en éthanol et $CO_2$.

• Purification des ARNm (ARN messagers) :

  • Caractérisés par une queue poly(A) en 3'.

  • Chromatographie d'affinité : Utilisation d'une colonne avec une phase fixe d'oligo(dT).

  • Procédure :

    1. Dépôt des ARN totaux à haute force ionique ($KCl\,0,5\,M$).

    2. Lavage pour éliminer les ARNr et ARNt ($KCl\,0,1\,M$).

    3. Élution des ARNm en abaissant la force ionique ($KCl\,0,01\,M$) et en augmentant la température.

• Ribo-Zero : Technique de précipitation des ARNr ($16S$ et $23S$) via des séquences complémentaires fixées sur billes magnétiques.

Caractérisation et Dosage des Acides Nucléiques

• Spectrophotométrie :

  • Absorption maximale à $\lambda = 260\,nm$ due aux bases azotées.

  • Concentrations pour une $A_{260} = 1$ :

    • ADN double brin : $50\,\mu g/ml$.

    • ADN simple brin : $25\,\mu g/ml$.

    • ARN : $40\,\mu g/ml$.

• Évaluation de la pureté par le ratio $A_{260}/A_{280}$ :

  • 1,8 - 2,0 : ADN pur et de bonne qualité.

  • < 1,8 : Contamination par des protéines ou des phénols.

  • > 2,0 : Contamination probable par de l'ARN.

• Note : L'absorption à $280\,nm$ caractérise les protéines (acides aminés aromatiques).

Séparation des Acides Nucléiques par Électrophorèse

• Principe : Séparation des molécules chargées négativement à $pH\,7-8$ vers l'anode (+) sous l'effet d'un champ électrique, à travers une matrice poreuse.

• Matrices de gel :

  • Agarose : Concentration de $0,5\%$ à $2\%$. Pour les fragments de grande taille ($200\,pb$ à plusieurs $kb$). Plus la concentration est élevée, plus les pores sont petits.

  • Polyacrylamide : Pour les très petits fragments ou le séquençage.

• Agents de détection :

  • Bromure d'éthidium (EtBr) : Agent intercalant et fluorochrome. Émet une fluorescence rouge-orangée sous lumière UV. Peut être remplacé par l'iodure de propidium.

• Facteurs influençant la migration :

  1. Taille (Poids moléculaire) : Les petits fragments migrent plus vite.

  2. Conformation : L'ADN superenroulé (forme I) migre le plus vite, suivi du linéaire (forme III), puis du circulaire ouvert (forme II).

  3. Voltage : Généralement limité à $5\,V/cm$ pour éviter l'échauffement et la fonte du gel.

  4. Concentration du gel.

Endonucléases de Restriction

• Généralités : Enzymes bactériennes servant de système de défense contre les bactériophages (système de restriction-modification).

• Caractéristiques des sites : Séquences inversées répétées appelées palindromes (ex: $5'\text{ GAATTC }3'$).

• Types de coupures :

  • Bouts collants (cohésifs) : Coupure décalée générant des extrémités 5' ou 3' sortantes (ex: EcoRI, PstI).

  • Bouts francs : Coupure au centre de la symétrie (ex: SmaI, EcoRV).

• Nomenclature (Exemple d'EcoRI) :

  • E : Genre (Escherichia).

  • co : Espèce (coli).

  • R : Variété/Souche (R).

  • I : Numéro d'ordre de découverte.

• Système Restriction-Modification : La bactérie protège son propre ADN par méthylation des bases au niveau des sites de restriction.

• Autres enzymes coupant l'ADN :

  • DNase 1 : Coupures aléatoires (« nicks ») sur simple ou double brin.

  • Nucléase S1 : Dégrade spécifiquement l'ADN simple brin.

  • Exonucléase III : Dégrade séquentiellement les nucléotides de $3' \rightarrow 5'$ à partir d'une extrémité 3'OH libre.

Vecteurs de Clonage

• Définition : Transporteur d'acide nucléique permettant sa réplication ou son expression dans une cellule hôte.

• Propriétés d'un vecteur :

  • Origine de réplication autonome.

  • Polylinker (MCS) : Site multiple de clonage contenant plusieurs sites de restriction uniques.

  • Gène de sélection (souvent résistance aux antibiotiques).

• Types de vecteurs : Plasmides, bactériophages, virus, BAC (Bacterial Artificial Chromosome), YAC (Yeast Artificial Chromosome).

• Souches d'E. coli hôtes :

  • DH5$\alpha$ : Pour les plasmides pUC18/pUC19.

  • HB 101 : Pour pBR322.

  • JM 109 : Dépourvue d'opéron lactose pour la sélection via la $\beta$-galactosidase.

Marquage des Acides Nucléiques et Sondes

• Sonde : Fragment d'ADN ou d'ARN marqué utilisé pour détecter des séquences homologues par hybridation (in situ, Southern, Northern).

• Marquage radioactif (Sondes chaudes) :

  • Isotopes : $^{32}P$ (le plus utilisé), $^{35}S$, $^{3}H$.

  • Marquage en 5' : Via la T4 polynucléotide kinase.

  • Marquage en 3' : Via l'ADN Polymérase ou la terminal transférase.

• Sondes froides :

  • Digoxigénine (DIG) : Détection par anticorps anti-DIG couplé à une enzyme (ex: phosphatase alcaline).

  • Biotine-Streptavidine.

Amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction)

• Historique : Développée par Kary Mullis en 1985 (Prix Nobel 1993).

• Principe : Multiplication exponentielle d'une séquence d'ADN in vitro.

• Réactifs nécessaires :

  • ADN cible.

  • Amorces (Primers) : Deux oligonucléotides de $20-30$ bases encadrant la zone à amplifier.

  • Taq Polymérase : Extraite de Thermus aquaticus, thermostable (active à $72^\circ C$, résiste à $95^\circ C$).

  • dNTPs : Mélange de dATP, dCTP, dGTP, dTTP.

  • Tampon : Contenant du $MgCl_2$ ($1,5\,mM$), Tris-HCl et KCl.

• Les 3 étapes d'un cycle de PCR :

  1. Dénaturation ($94\,^\circ C - 95\,^\circ C$) : Séparation des deux brins d'ADN.

  2. Hybridation ($50\,^\circ C - 60\,^\circ C$) : Fixation des amorces sur les séquences complémentaires. La température dépend de la $T_m$ des amorces.

  3. Élongation ($72\,^\circ C$) : Synthèse du brin complémentaire par la Taq polymérase de $5' \rightarrow 3'$.

• Cinétique : L'amplification est exponentielle ($2^n$). Après $35$ cycles, on peut obtenir environ $2^{35} \approx 34$ milliards de copies.