Genomo Sandara ir Funkcijos

Genomo struktūra ir funkcijos

Įvadas į Genetiką ir Genomiką

• Genetika akcentuoja ir tiria organizmų paveldimumą ir kintamumą. Tai yra tradicinė biologijos sritis, kurios pagrindinis tyrimo objektas yra genai ir jų perdavimas iš kartos į kartą.

• Genomika atsirado vėliau ir apima platesnį požiūrį, tirdama visą genomo turinį, įskaitant visus genus ir jų tarpusavio sąveiką, funkcijas, reguliavimą, struktūrą, evoliuciją. Ji naudojasi šiuolaikiniais metodais, skirtais analizuoti genomo rezultatus.

• Terminas „genomas“ apibrėžia visą organizmo genetinės informacijos rinkinį: tai žmogaus atskiro individo genetinių elementų visuma.

• Terminas „genotipas“ reiškia konkretaus individo visų genetinių elementų (genų, alelių) sudėtį.

• Genas yra DNR seka, kuri dažniausiai koduoja baltymą, turi funkcinę reikšmę. Yra ir genų, kurie koduojami, bet nėra verčiami į baltymus (pvz., RNR genai, kurie tiesiogiai atlieka funkcijas).

• Aleliai yra konkretaus geno variantai. Žmogus gali turėti daugiausiai du alelius (po vieną iš kiekvieno tėvų). Jei abu aleliai yra vienodi, individas yra homozigotinis; jei skirtingi – heterozigotinis.

Nukleorūgštys: DNR ir RNR

• Nukleorūgštys (DNR ir RNR) yra cheminių junginių grupė, kuri koduoja, perdirba, realizuoja genetinę informaciją ir perduoda ją iš kartos į kartą.

• Nukleorūgštys yra biopolimerai, sudaryti iš daugelio monomerinių vienetų, vadinamų nukleotidais.

• Kiekvienas nukleotidas susideda iš trijų pagrindinių elementų:

  • Azotinė bazė: gali būti purino (Adeninas (A), Guaninas (G)) arba pirimidino (Citozinas (C), Timinas (T) arba Uracilas (U)) tipo.

    • Purinas: dvigubų ciklų junginiai su azoto molekulėmis.

    • Pirimidinas: monociklinių junginių tipas, turintis azoto.

  • Pentozė (penkių anglies atomų cukrus): deoksiribozė (DNR atveju) arba ribozė (RNR atveju).

  • Fosfato grupė: sudaryta iš fosforo rūgšties liekanos.

• DNR (Deoksiribonukleorūgštis):

  • Sudėtyje yra Timinas (T).

  • Cukrus – deoksiribozė (neturi hidroksilo grupės ant $2$ anglies atomo).

  • Dažniausiai yra dvigrandė struktūra.

• RNR (Ribonukleorūgštis):

  • Sudėtyje yra Uracilas (U) vietoj Timino (T).

  • Cukrus – ribozė (turi hidroksilo grupę ant $2$ anglies atomo).

  • Dažniausiai yra vienagrandė struktūra.

• Nukleotidų jungimasis ir DNR grandinės formavimasis:

  • Nukleotidai jungiasi vienas su kitu kondensacijos reakcijos metu, formuodami fosfodiesterines jungtis (tarp vieno nukleotido trečiojo anglies atomo ir kito nukleotido penktojo anglies atomo, per fosforo rūgšties liekaną).

• DNR antrinė struktūra (dviguba spiralė):

  • Sudaro dvi nukleotidų grandinės, susijungusios komplementarumo principu:

    • Adeninas (A) visada jungiasi su Timinu (T) (dviem vandenilinėmis jungtimis).

    • Guaninas (G) visada jungiasi su Citozinu (C) (trimis vandenilinėmis jungtimis).

  • Šios vandenilinės jungtys stabilizuoja spiralės struktūrą.

  • Žmogaus chromosoma turi apie $2 imes 10^8$ iki $2.5 imes 10^8$ bazių porų. Dvigrandė DNR seka vadinama komplementarumo principu.

  • DNR erdvinės struktūros tipai: A, B ir Z. B forma yra aktyviausia ir dominuojanti gyvojoje gamtoje, būdinga dešininės sukimo spiralės struktūrai.

• DNR replikacija:

  • DNR kopijavimo procesas, kurio metu iš vienos DNR molekulės susidaro dvi identiškos.

  • Replikacija vyksta dvipusiai – abiem kryptimis nuo pradžios taško.

  • Viena grandis sintetinama tolygiai ($5'$ į $3'$ kryptimi), kita grandis – fragmentais, vadinamais Okazaki fragmentais (taip pat $5'$ į $3'$ kryptimi).

RNR rūšys ir funkcijos

• Pirminė RNR grandinė toliau formuojasi į antrinę ir tretinę struktūras, kurios yra labai svarbios RNR funkcijai.

• Antrinė RNR struktūra formuojasi, kai RNR grandinė susisuka ir sudaro vandenilines jungtis su savimi (pvz., „dobilo lapo“ struktūra transportinėje RNR).

• RNR funkcijos organizme yra įvairios:

  • Informacinė RNR (iRNR arba mRNR): perduoda genetinę informaciją iš DNR į baltymų sintezės vietas (ribosomas).

  • Transportinė RNR (tRNR): perneša aminorūgštis į ribosomas baltymų sintezės metu.

  • Ribosominė RNR (rRNR): sudaro ribosomų struktūros pagrindą ir atlieka transliacijos funkciją (aminorūgščių jungimą į baltymų grandinę).

  • Mažosios reguliacinės RNR (pvz., miDNK): aptinkamos tik eukariotuose ir atlieka geno raiškos reguliavimo funkcijas. Šios RNR neaptinkamos primityviuose organizmuose.

  • Kitos RNR rūšys, aptinkamas visuose (arba beveik visuose) gyvuose organizmuose (eukariotuose ir prokariotuose).

  • Kai kurios RNR atlieka fermentines funkcijas (pvz., ribosomos) arba gynybines funkcijas (pvz., prieš virusus, blokuodamos jų DNR ar RNR).

Mitochondrinė DNR (mtDNR)

• mtDNR – tai žiedo formos DNR molekulė, esanti mitochondrijose.

• Dydis ir genų skaičius:

  • Branduolio DNR (nDNA) žmogaus ląstelėje yra labai didelė (nuo $3 imes 10^9$ nukleotidų porų), o mtDNR yra daug mažesnė (apie $16$ tūkstančių nukleotidų porų).

  • mtDNR koduoja tik $37$ genus.

• Lokalizacija:

  • Branduolio genome randama daugiausia po vieną kiekvieno baltymo kopiją (vienas genas – viena iRNR, kuri sintetinamas baltymas).

  • Mitochondrijose yra daug kopijų (nuo dešimčių iki kelių šimtų molekulių kiekvienoje mitochondrijoje), o mitochondrijų ląstelėje gali būti tūkstančiai.

• Transkripcija:

  • mtDNR vyksta policistroninė transkripcija: iš vienos ilgos iRNR molekulės susidaro kelios funkcinės RNR molekulės.

  • Branduolio DNR atveju dažniausiai vyksta monocistroninė transkripcija (vienas genas – viena iRNR).

• Paveldimumas:

  • mtDNR paveldima tik iš motinos (spermatozoidas į kiaušialąstę perduoda tik branduolio genomą, o mitochondrijos ir citoplazma lieka iš kiaušialąstės). Todėl vyriškos lyties atstovai nepaveldi mtDNR iš savo tėvo.

• Evoliucinė kilmė: mtDNR kilmė siejama su endosimbiogenezės teorija, kuri teigia, kad mitochondrijos išsivystė iš laisvai gyvenusių bakterijų, kurios buvo absorbuotos pirmykštės eukariotinės ląstelės.

Žmogaus chromosomos ir genomas

• Žmogaus genomas sudaro apie $3$ milijardus nukleotidų porų (iš viso $23$ poros chromosomų).

• Genų skaičius: apie $20,000 - 25,000$ genų. Tai nėra labai didelis skaičius palyginti su genomo dydžiu, kas rodo, kad didelė genomo dalis yra nekoduojanti.

• Chromosomos morfologija keičiasi ląstelės ciklo metu:

  • Interfazinėje ląstelėje chromosomos yra dekondensuotos ir neįmanoma jų matyti mikroskopu.

  • Metafazinės chromosomos yra maksimaliai kondensuotos, matomos mikroskopu, ir turi būdingą struktūrą (du chromatidai, centromera).

• Kariotipas yra visų somatinių ląstelių chromosomų rinkinys, suklasifikuotas pagal dydį ir grupes (nuo A iki G), ir yra išdėstytas pagal atitinkamą tvarką.

  • A grupės chromosomos yra didžiausios, o G grupės – mažiausios. Didėja genetinis kintamumas.

• Lytinės chromosomos: X ir Y (X yra didesnė, Y mažesnė). Kitos chromosomos vadinamos autosomomis.

Chromosomų struktūros elementai

• DNR kompaktiškumo lygiai chromosomose (nuo mažiau supakuotos iki labiausiai supakuotos):

  1. Nukleosomos: tai pagrindinė chromatinų struktūros vienetas. DNR dviguba grandinė apsivijo histonų baltymų šerdį (oktamerą) du kartus. Histonai yra labai konservatyvūs baltymai, nekoduojantys jokios aminorūgščių sekos variacijos.

  2. Solenoidas: nukleosomos susijungia viena su kita ir formuojasi į spiralę (apie $6$ nukleosomas viename posūkyje).

  3. Chromatino kilpos: solenoidas toliau susiformuoja į kilpas, kurios prisijungia prie nehistoninių baltymų karkaso, specifinėse vietose vadinamose SCAF (scaffold attachment regions).

  4. Metafazinė chromosoma: maksimaliai kondensuota struktūra, kurią galima matyti šviesos mikroskopu. Ji yra maždaug $10,000$ kartų trumpesnė už dekondensuotą DNR molekulę.

• Euchromatinas ir Heterochromatinas:

  • Euchromatinas: tai mažiau kondensuota genomo dalis, kurioje yra aktyvūs genai, vykstanti intensyvi transkripcija. Sudaro apie $1-5$ % viso žmogaus genomo. Čia yra daugiausia koduojančių sekų.

    • Euchromatinas turi atvirą struktūrą, nes histonai yra mažiau acetilinti ar kitokiu būdu modifikuoti, tai leidžia pasiekti DNR.

  • Heterochromatinas: tai labai kondensuota genomo dalis, kurioje genų raiška nevyksta (arba vyksta labai silpnai). Šios sritys yra genetiškai neaktyvios.

    • Jo struktūra yra labai tanki, genomos virškė nesvykina transkripcija.

    • Skirstomas į konstitucinį heterochromatiną (pastovi genemo dalis, pvz., centromeros ir telomeros srityse) ir fakultatyvinį heterochromatiną (kurio kondensacija gali kisti, pvz., inaktyvuota X chromosoma).

Specifinės Chromosomų dalys

• Centromera:

  • Specifinė chromosomos sritis, kurioje jungiasi seserinės chromatidės. Ji dalija chromosomą į du petys: trumpąjį (p) ir ilgąjį (q).

  • Pagrindinė centromeros funkcija yra tikslus genetinės informacijos paskirstymas dukterinėms ląstelėms ląstelių dalijimosi metu. Prie centromeros prisijungia mitozinės verpstės siūlai.

  • Pagal centromeros padėtį, chromosomos skirstomos į tipus:

    • Metacentrinės: centromera yra per vidurį, p ir q petys yra vienodo ilgio.

    • Submetacentrinės: centromera yra arčiau vieno galo, p petys yra trumpesnis nei q petys.

    • Akrocentrinės: centromera yra labai arti vieno galo, beveik galinio ilgio petys, o trumpasis petys yra labai trumpas, suformuojantis satelitus.

• Telomerai:

  • Specifinės DNR sekos, esančios chromosomų galuose. Žmogaus telomerai sudaryti iš pasikartojančių sekų $TTAGGG$ (~$6$ nukleotidų ilgio).

  • Funkcija: Apsaugo DNR galus nuo pažeidimų ir susidėvėjimo replikacijos metu. Kadangi DNR replikacija negali pilnai nukopijuoti chromosomos galų (dėl Okazaki fragmentų), telomerai sutrumpėja po kiekvienos ląstelės replikacijos.

  • Telomerazė: fermentas, kuris ilgina telomerus. Jis yra aktyvus embrioninėse ląstelėse, kamieninėse ląstelėse ir vėžinėse ląstelėse, užtikrindamas, kad telomerai nesutrumpėtų ir ląstelės galėtų dalytis neribotai.

    • Su amžiumi ir pakartotiniais ląstelių dalijimaisis somatinėse ląstelėse telomerazės aktyvumas mažėja, o telomerai trumpėja, kas siejama su ląstelių senėjimu.

• Akrocentrinių chromosomų satelitai:

  • Būdingi akrocentrinėms chromosomoms. Juos sudaro branduolėle formuojantis chromatinas (tankus chromatinas).

  • Šioje srityje intensyviai vyksta RNR polimerazės transkripcija, nes čia yra ribosominės RNR genai, kurie koduoja ribosomų baltymus. Dėl to šios sritys yra labai aktyvios genų raiškos požiūriu.

Nekoduojančios ir pasikartojančios sekos

• Didelę dalį žmogaus genomo (~$98-99$%) sudaro nekoduojančios sekos, kurios anksčiau buvo vadinamos „šlamšto DNR“, bet dabar žinoma, kad daugelis jų atlieka svarbias reguliavimo funkcijas.

  • Koduojančios sekos (genai) sudaro tik apie $1-2$ % genomo.

• Genai sudaryti iš:

  • Egzonų: koduojančios sritys, išreiškiančios genetinę informaciją (aminorūgščių seka).

  • Intronų: nekoduojančios sritys, esančios tarp egzonų. Intronai yra pašalinami brandinant RNR spleisingo metu.

  • Reguliuojančių sekų (cis-elementų ir trans-elementų): reguliuoja genų raišką.

    • Cis-elementai: DNR sekos, esančios toje pačioje DNR molekulėje arti geno (pvz., promotoriai, stiprintuvai).

    • Trans-elementai: genų raišką reguliuojantys elementai, esantys tolimesnėse genomo srityse (pvz., izoliatoriai, represoriai).

• Pseudogenai:

  • DNR sekos, labai panašios į unikalius genus, bet dėl mutacijų yra neaktyvios (nevyksta transkripcija ir transliacija).

• Pasikartojančios sekos:

  • Sudaro labai didelę genomo dalį, skirstomos į tandemines (viena po kitos) ir išbarstytas (išsidėsčiusios po visą genomą).

  • Satelitų DNR: didelės pasikartojančių fragmentų grupės. Gali būti skirtingų tipų (alfa, beta, gama). Jos dažnai lokalizuojasi prie centromerų arba telomerų.

  • Minisatelitai: DNR fragmentų pasikartojimai (apie $10-100$ bp ilgio). Labai polimorfiniai (daug variacijų populiacijoje). Naudojami tėvystės nustatymui ir teismo ekspertizėms.

    • Jų funkcija yra susijusi su genetine rekombinacija (krosingoveriu).

  • Mikrosatelitai: labai trumpi DNR fragmentų pasikartojimai (apie $2-5$ bp ilgio). Taip pat labai polimorfiniai ir pasiskirstę po visą genomą.

    • Jie gali būti randami tiek koduojančiose, tiek nekoduojančiose srityse, genų viduje ar šalia jų.

    • Jų pokyčiai gali pakeisti genų raišką. Naudojami tėvystės nustatymui, populiacijų tyrimams, ligų diagnostikai.

• Transpozonai (šoklūs genai):

  • DNR elementai, kurie gali judėti genomo viduje.

  • Retrotranspozonai: kopijuoja savo fragmentą ir įterpia jį kitoje vietoje. Jų struktūra ir funkcija artima retrovirusams.

  • DNR transpozonai: „iškerpa“ savo fragmentą iš vienos vietos ir „įterpia“ jį kitoje. Yra autonominiai (gali judėti patys) ir neautonominiai (reikalauja autonominių transpozonų fermentų pagalbos).

  • Daugelis žmogaus transpozonų yra inaktyvuoti dėl mutacijų, bet kai kurie vis dar gali būti aktyvūs.

  • Jie gali sukelti mutacijas, pakeisti genų raišką ir yra svarbūs evoliucijoje.

  • Kai kurie transpozonai buvo susieti su paveldimomis ligomis, pvz., Fragile X sindromas (FMR1 geno tripleto (CGG) pasikartojimai).

Genomo analizės ir mutacijos

• Genomas nėra pastovus; jis yra nuolat veikiamos evoliucijos ir pokyčių (mutacijų) per milijonus metų.

• Genų raiška yra intensyviai reguliuojama ir kontroliuojama.

• Mutacijos gali atsirasti koduojančiose ir reguliuojančiose sekose. Nors mutuojančių koduojančių sekų genetiškai yra mažiau, tačiau reguliuojančios sekos yra labiau linkusios į mutacijas.

• Genų šakų (gene families) egzistuoja, pavyzdžiui, histonų, alfa ir beta globino šeimos, kurių genai yra labai konservatyvūs ir aptinkami visuose organizmuose.

• Retų variantų (rare variants) atsiradimas ir jų įtaka individų skirtumams. Šios mutacijos yra ypatingos ir gali turėti didelės įtakos fenotipui. Turime apie $23$ % genomo, kuris yra genetinės informacijos heterochromatinas, kurio genetinė informacija yra heterochromatinas.

Chromosomų morfologija ir genomo elementų lokalizacija

• Kariotipavimas leidžia vizualizuoti ir klasifikuoti chromosomas ląstelės metafazės stadijoje. Tai padeda nustatyti chromosomų skaičiaus ir struktūros pakitimus.

• Lytinės chromosomos (X ir Y) lemia individo lytį.

• Nekoduojančios sekos sudaro didžiąją genomo dalį ir gali būti unikalios arba daugkartiniai pasikartojimai.

• Konservatyvūs genai (pvz., histonų) turi labai mažai variacijos, nes bet kokia mutacija būtų letali.

• Polimorfinės sritys su pasikartojančiomis sekomis yra labai naudingos tėvystės nustatymui ir identifikavimui dėl didelio kintamumo individų populiacijose.

  • Tiriant specifines mikrosatelitų ar minisatelitų sritis (pvz., $4 imes$ $6$ pasikartojimai, $9 imes$ $5$ pasikartojimai), galima palyginti vaiko ir tėvų genomus.

  • Šiuolaikinės technologijos leidžia labai dideliu tikslumu nustatyti giminystės ryšius (tikimybė viršija $99.9$ %).