短非編碼RNA：微RNA (miRNA) 筆記

非編碼RNA的第二部分，主要關注短非編碼RNA，特別是微RNA（miRNA）。

微RNA簡介

  • 分類: 非編碼RNA可分為長非編碼RNA和短非編碼RNA。

  • 本次課程重點: 探討短非編碼RNA，特別是微RNA的調控作用、生物合成與加工，以及其作用機制——RNA干擾。

  • 重要性: 微RNA在複雜的基因調控網絡中扮演關鍵角色，例如與甲基轉移酶的相互作用。

微RNA的概況與特性

  • 發現: 首次於19931993年在線蟲秀麗隱桿線蟲（C. elegans）中被描述。

  • 演變歷程: 該領域在發現後約1010年間相對停滯，主要因未認識到這些分子從線蟲到高等生物（如哺乳動物和靈長類）的高度保守性。

  • 研究進展: 隨著發現大多數真核生物基因組編碼微RNA，研究和理解程度顯著提升。

  • 分子特點:

    • 大小: 約2020到2525個核苷酸。

    • 結構: 單鏈。

    • 分類: 屬於調控性非編碼RNA。

  • 調控方式: 通過與其靶標信使RNA（mRNA）結合，導致其降解或抑制其翻譯。

  • 重要性數據（以人類為例）:

    • 約22%的人類基因編碼微RNA。

    • 然而，約6060%的蛋白質編碼基因受微RNA調控。

  • 表達模式:

    • 組成性（Constitutive）表達: 例如，在體細胞中，獨立於特定代謝狀態表達。

    • 個體發育（Ontogenetic）表達: 在胚胎發育過程中表達。

    • 組織/細胞特異性: 微RNA的細胞內濃度因組織或細胞類型而異，不同微RNA在不同分化細胞中表達。

  • 調控角色: 其調控作用可與真核生物中基因表達的重要調控因子——轉錄因子——相媲美。

  • 參與的生物過程: 發育、細胞分化、增殖（細胞分裂）、細胞凋亡（程序性細胞死亡，例如免疫細胞在吞噬病原體後誘導凋亡以清除病原體）、免疫應答。

  • 病理學關聯: 微RNA的失調可能導致多種疾病:

    • 癌症（一個突出的例子）。

    • 慢性炎症性腸病。

    • 病毒感染：某些病毒基因組也編碼微RNA，以影響宿主細胞的調控機制。

  • 作用機制: 通過RNA干擾。

微RNA的演化意義

  • 物種複雜性與非編碼RNA多樣性: 非編碼RNA的增加和多樣性有助於動物在演化過程中變得更複雜。

  • 微RNA家族: 序列相似的微RNA分子被歸為一個家族。

    • LET-77家族: 在兩側對稱動物（Bilateria）中存在，但在刺胞動物（Cnidaria，如水母、珊瑚）和海綿（Porifera）中缺失。該家族的名稱「LET」來自「Lethal」，表明將其從基因組中敲除會對動物產生致命影響，可能與更複雜的形態形成有關。

    • 脊椎動物（Vertebrates）: 共通擁有5656個新的微RNA家族，這些家族在較低等的動物中不存在。

    • 真獸亞綱（Eutheria）: 額外有4040個新的微RNA家族。

    • 靈長類（Primates）: 擁有數個靈長類特異的微RNA。

  • 結論: 微RNA家族在演化過程中的獲得與生物體結構複雜性的增加相關。

微RNA的基因組整合與作用機制

  • 基因結構: 基因包含啟動子區，其中含有轉錄因子的結合位點，這些因子可正向或負向影響基因表達。RNA聚合酶結合於啟動子區進行轉錄。除了這些，還存在微RNA結合位點。

  • mRNA上的微RNA結合位點: 微RNA結合位點位於信使RNA（mRNA）上，通常在3′3'非翻譯區（3′3' UTR）。

    • mRNA結構: 包含5′5'帽子、外顯子（內含子已被剪接移除）以及3′3'聚腺苷酸尾巴。

    • 非翻譯區（UTR）: mRNA包含5′5' UTR（在編碼序列之前）和3′3' UTR（在編碼序列之後）。這些區域不編碼蛋白質，但可以包含調控序列。

  • 微RNA與靶mRNA的結合: 微RNA不單獨結合，而是與一種稱為RISC（RNA誘導沉默複合體，英文全稱為 microRNA-induced silencing complex）的蛋白質複合體結合。

    • 結合方式: 通過不完全互補（partial complementarity）與目標mRNA的3′3' UTR結合。這種結合通常在中間區域形成一個「氣泡」，因為該處微RNA和mRNA之間缺乏互補性。

  • RNA干擾的後果:

    • 聚腺苷酸尾巴降解和mRNA降解: RISC-miRNA複合體結合後，可導致聚腺苷酸尾巴（Poly-A tail）被移除。由於聚腺苷酸尾巴對mRNA的穩定性和保護至關重要，其降解會導致mRNA隨後被降解（Decapping，即5′5'帽結構的移除，也會導致mRNA降解）。

    • 翻譯抑制（Translational Inhibition）: 即使mRNA不被完全降解，微RNA的結合也可以抑制蛋白質的翻譯，從而導致該基因的表達下調（「基因沉默」或「silencing」）。

    • RNA環狀結構的解體: 在細胞中，mRNA通常形成一個閉合的環狀結構，通過5′5'帽與3′3'聚腺苷酸尾巴之間通過其他蛋白的相互作用而形成。這種結構對於有效的翻譯至關重要。RISC-miRNA複合體的結合會破壞這個閉合環形結構，進一步導致mRNA的降解或翻譯抑制。

  • 完全互補配對（主要發生在植物中）: 如果微RNA與靶mRNA是100100%互補配對，Argonaut蛋白（Argo2）會直接在結合區域切斷mRNA，導致其降解。

微RNA的生物合成與加工

  • 起源: 微RNA在動物細胞的細胞核和細胞質中產生，其轉錄和加工包括多個步驟。

  • 轉錄: 微RNA基因通常由RNA聚合酶IIII轉錄，產生初級微RNA（primary miRNA，簡稱pri-miRNA）。

    • 來源一: 作為獨立的基因轉錄產物。

    • 來源二（Merotrons）: 也可以從內含子中產生。當基因被RNA聚合酶IIII轉錄生成mRNA前體，並在外顯子被剪接和連接後，一些內含子本身可以攜帶編碼微RNA的信息，形成莖環結構。這表明內含子並非僅是「基因垃圾」，而是可能包含調控信息。

  • 加工步驟:

    1. 細胞核內加工（Pri-miRNA到Pre-miRNA）:

      • Pri-miRNA在細胞核內形成一個莖環（stem-loop）結構，通過內部氫鍵鹼基配對。

      • Drosha酶: 一種核酸內切酶，會切割莖環的底部，生成一個較短的前體微RNA（precursor miRNA，簡稱pre-miRNA）。

    2. 細胞核輸出:

      • Pre-miRNA通過核孔，由輸出蛋白輸出蛋白55（Exportin 55）轉運至細胞質。

    3. 細胞質內加工（Pre-miRNA到miRNA二聚體）:

      • Dicer酶: 另一種核酸內切酶，在細胞質中進一步切割pre-miRNA的環狀結構，生成一個雙鏈的微RNA（miRNA duplex）。

    4. RISC組裝與成熟miRNA:

      • 雙鏈miRNA中的一條鏈被識別為「活性鏈」（即成熟微RNA），並被加載到RISC複合體中。

      • 另一條鏈（稱為「乘客鏈」或「passenger strand」）通常會被降解，因為我們需要單鏈微RNA來與靶標mRNA結合。

  • 作用機制總結: RISC複合體結合成熟的單鏈微RNA，然後結合到靶標mRNA的3′3' UTR區域，通過不完全互補性來抑制蛋白質翻譯和/或導致mRNA降解（RNA沉默）。