Mikrobiologia - Badanie Czystości Mikrobiologicznej, Antybiogramy i Fitoncydy

Mikrobiologia: Wprowadzenie i Ocena Czystości Mikrobiologicznej Powietrza

  • Powietrze jest środowiskiem nieprzyjaznym dla rozwoju drobnoustrojów, ponieważ brakuje w nim odpowiednich składników odżywczych oraz panują zmienne warunki fizyczne.

  • Mimo braku możliwości aktywnego rozwoju, mikroorganizmy zachowują w powietrzu swój potencjał infekcyjny, co stanowi zagrożenie epidemiologiczne.

  • Badanie czystości mikrobiologicznej powietrza służy jako wskaźnik poprawności działania systemów wentylacyjno-klimatyzacyjnych, co jest krytyczne w środowisku szpitalnym.

  • Metody badania czystości powietrza:

    • Metody mikroskopowe: Polegają na przepuszczeniu powietrza przez filtr membranowy. Mikroorganizmy osadzane są na szkiełku mikroskopowym pokrytym wazeliną. Pozwala to na wykrycie organizmów żywych, martwych oraz trudnych do hodowli, a także pyłków. Wadą jest trudność w identyfikacji gatunkowej.

    • Metody hodowlane: Polegają na zebraniu mikroorganizmów bezpośrednio na płytkę z pożywką. Po inkubacji zlicza się wyrośnięte kolonie. Wadą jest wykrywanie jedynie form zdolnych do wzrostu na zastosowanym podłożu.

    • Metody wiązane: Łączą obie powyższe techniki. Przykłady to metoda sedymentacyjna oraz metody mechanicznego oddzielania (filtracyjne, zderzeniowe, odśrodkowe).

  • Metoda Sedymentacji Kocha:

    • Jest to najstarsza metoda, wciąż stosowana na salach operacyjnych.

    • Pozwala oszacować stężenie drobnoustrojów w miejscach o niskim ruchu powietrza.

    • Procedura doświadczenia:

      1. Płytkę Petriego z podłożem LA (agar odżywczy) należy pozostawić otwartą na 30 minut30\,\text{minut} w wybranym pomieszczeniu (sala, korytarz, toaleta).

      2. Zamknąć płytkę i inkubować przez 24−48 godzin24-48\,\text{godzin} w temperaturze 37∘C37^\circ\text{C}.

      3. Zliczyć kolonie i obliczyć jednostki tworzące kolonie (jtk/CFUjtk/CFU) w 10 l10\,l powietrza.

    • Wzór obliczeniowy:         N=a×100b×cN = \frac{a \times 100}{b \times c}

      • NN: liczba drobnoustrojów (jtkjtk) w 10 l10\,l (10 dm310\,dm^3) powietrza.

      • aa: liczba kolonii wyrosłych na płytce.

      • bb: powierzchnia płytki (78.5 cm278.5\,cm^2 dla średnicy 10 cm10\,cm).

      • cc: współczynnik czasu ekspozycji (0.2×czas w minutach0.2 \times \text{czas w minutach}). Dla 5 min5\,\text{min} c=1c=1, dla 10 min10\,\text{min} c=2c=2, dla 15 min15\,\text{min} c=3c=3, dla 30 min30\,\text{min} c=6c=6.

      • 100100: przelicznik powierzchni na 100 cm2100\,cm^2.

  • Normy zanieczyszczenia (bakterie tlenowe):

    • Laboratorium mikrobiologiczne: do 2 jtk/10 l2\,jtk/10\,l.

    • Sale wykładowe i ćwiczeniowe: do 20 jtk/10 l20\,jtk/10\,l.

    • Sale operacyjne: do 1 jtk/10 l1\,jtk/10\,l.

Ocena Czystości Mikrobiologicznej Skóry Dłoni i Techniki Higieny

  • Doświadczenie drugie: Porównanie czystości dłoni w różnych stanach: palec brudny, po tradycyjnym myciu oraz po dezynfekcji trwającej 30 sekund30\,\text{sekund}.

  • Technika mycia rąk (metoda Ayliffe’a):

    • Czas trwania procedury: 40−60 sekund40-60\,\text{sekund}.

    • Etapy:

      1. Zmoczenie rąk wodą.

      2. Nabranie mydła.

      3. Pocieranie dłoni o siebie.

      4. Pocieranie grzbietu lewej dłoni prawą dłonią (z przeplataniem palców) i zmiana stron.

      5. Pocieranie dłoni o dłonie z przeplataniem palców.

      6. Pocieranie grzbietów palców o drugą dłoń (splot).

      7. Obrotowe pocieranie lewego kciuka w prawej dłoni i zmiana stron.

      8. Obrotowe pocieranie wnętrza dłoni zaciśniętymi palcami drugiej ręki i zmiana stron.

      9. Opłukanie rąk.

      10. Osuszenie jednorazowym ręcznikiem.

      11. Zakręcenie kranu za pomocą ręcznika.

  • Doświadczenie trzecie: Ocena występowania bakterii na powierzchniach takich jak klawiatura, telefon, klamka czy pieniądze poprzez odcisk na agarze (10 sekund10\,\text{sekund}) lub posiew wymazu.

Nosicielstwo Staphylococcus aureus i Badanie Bakteriologiczne

  • Nosicielstwo: Stała lub przejściowa obecność patogenów w organizmie bez objawów choroby. Drobnoustrój namnaża się i jest wydalany, ale pozostaje w równowadze z florą gospodarza.

  • Rodzaje nosicielstwa:

    • Stałe (np. dur brzuszny).

    • Tymczasowe (np. u ozdrowieńców, zazwyczaj do 3 miesięcy3\,\text{miesięcy} po chorobie).

  • Przykłady lokalizacji:

    • S. aureus: przedsionek nosa, gardło.

    • S. pneumoniae: jama nosowo-gardłowa.

    • Enterococcus: okolice odbytu.

    • Neisseria meningitidis: nos, gardło.

    • Haemophilus: górne drogi oddechowe.

  • Doświadczenie czwarte (S. aureus):

    • Pobranie wymazu jałowym wacikiem zwilżonym sola fizjologiczną z przedsionka nosa (głębokość ok. 2 cm2\,cm, obrót 3−43-4 razy).

    • Wykonanie posiewu wężykowatego na podłoże Chapmana.

    • Inkubacja: 24−48 godzin24-48\,\text{godzin} w 37∘C37^\circ\text{C}.

Antybiogram: Metody Oznaczania Wrażliwości Bakterii na Antybiotyki

  • Antybiogram: Badanie in vitro określające wrażliwość lub oporność bakterii na dany lek, jego spektrum oraz skuteczne stężenie.

  • Parametry ilościowe:

    • MIC (Minimum Inhibitory Concentration): Najmniejsze stężenie leku hamujące wzrost bakterii (jednostka: μg/ml\mu\text{g/ml} lub mg/lmg/l).

    • MBC (Minimum Bactericidal Concentration): Najmniejsze stężenie leku zabijające 99.9%99.9\% populacji bakterii.

  • Metody oznaczania:

    • Metoda jakościowa (krążkowo-dyfuzyjna):

      • Podłoże: Mueller Hinton Agar (MH).

      • Gęstość zawiesiny: 0.5 McFarlanda0.5\,\text{McFarlanda}.

      • Wykorzystuje krążki nasączone antybiotykiem. Wynikiem jest średnica strefy zahamowania wzrostu w mmmm po 16−18 h16-18\,\text{h} inkubacji.

    • Metoda ilościowa (seryjnych rozcieńczeń): Szukanie najniższego stężenia, przy którym nie występuje zmętnienie podłoża (wzrost).

    • E-test (metoda ilościowo-jakościowa): Plastikowy pasek z gradientem stężeń antybiotyku uwalnianym do podłoża. Po inkubacji powstaje elipsowata strefa zahamowania, a miejsce jej przecięcia z paskiem wskazuje wartość MIC.

Fitoncydy: Naturalne Substancje Przeciwbakteryjne

  • Fitoncydy: Związki produkowane przez rośliny wyższe (mszaki, paprotniki, nasienne), będące odpowiednikami antybiotyków. Mogą być wydzielane przez kora, liście, kwiaty.

  • Działanie:

    • Bakteriobójcze, bakteriostatyczne, grzybobójcze, fungistatyczne, pierwotniakobójcze, przeciwwirusowe.

    • Pobudzają krążenie, trawienie, wzmagają apetyt.

    • Obniżają poziom cholesterolu i glukozy, hamują agregację krwinek (przeciwdziałanie miażdżycy).

  • Rośliny bogate w fitoncydy:

    • Iglaste: Jałowiec (Juniperus), Sosna (Pinus), Świerk (Picea), Jodła (Abies), Żywotnik (Thuja).

    • Liściaste: Jarzębina (Sorbus), Buk (Fagus), Porzeczka czarna (Ribes nigrum), Jaśminowiec (Philadelphus).

    • Zielne/Warzywa: Cebula, Czosnek, Szałwia (antyseptyczna), Kolendra (rozkurczowa), Tymianek, Macierzanka (przeciw paciorkowcom), Imbir, Kurkuma, Papryka, Goździki.

    • Citrospet: Wyciąg z grejpfruta.

Procedura Wykonywania Antybiogramu i Kontrola Jakości

  • Schemat wykonania (dyfuzyjno-krążkowa):

    1. Podpisanie płytki Petriego MH.

    2. Przygotowanie zawiesiny o gęstości 0.5 McFarlanda0.5\,\text{McFarlanda} (≈108 komoˊrek/ml\approx 10^8\,\text{komórek/ml}) w 2 ml2\,ml soli fizjologicznej. Pomiar absorbancji w densytometrze przy λ=600 nm\lambda = 600\,nm.

    3. Posiew murawkowy zawiesiny (obracanie płytki 4 razy4\,\text{razy} o 60∘60^\circ, przetarcie brzegów agaru).

    4. Odczekanie 2−3 min2-3\,\text{min} na wchłonięcie zawiesiny.

    5. Nałożenie jałowych krążków bibułowych (pęseta wyżarzana w płomieniu po uprzednim zanurzeniu w denaturacie).

    6. Nakropienie 5 μl5\,\mu l badanego związku (antybiotyk, olejek eteryczny, wyciąg roślinny).

    7. Inkubacja w temp. 35±2∘C35 \pm 2^\circ\text{C} przez 16−24 godz16-24\,\text{godz}.

  • Czynniki wpływające na wynik:

    • Gęstość inokulum: Zbyt mała gęstość zawyża strefę zahamowania (fałszywa wrażliwość), zbyt duża ją zaniża.

    • Grubość agaru: Cienkie podłoże zwiększa strefę zahamowania, grube ją zmniejsza.

    • Ułożenie krążków: Złe rozmieszczenie może powodować zniekształcenia lub nakładanie się stref.

  • Przykłady antybiotyków i fitoncydów:

    • Antybiotyki: Amoksycylina (Beta-laktamy), Amoksycylina z kwasem klawulanowym (Beta-laktamy), Klarytromycyna (Makrolidy), Lewofloksacyna (Fluorochinolony).

    • Olejki eteryczne: sosnowy, świerkowy, lawendowy, cynamonowy, rozmarynowy, z drzewa herbacianego, eukaliptusowy.

Diagnostyka Candida albicans i Wpływ Promieniowania UV

  • Doświadczenie szóste (E-test dla C. albicans): Odczyt MIC i interpretacja (S - wrażliwy, I - wrażliwy przy zwiększonej ekspozycji, R - oporny) według norm EUCAST (2 grudnia 2024).

    • Amfoterycyna B (AMB): S ≥1\ge 1, R < 1. Odczyt: 1 μg/ml1\,\mu\text{g/ml}.

    • Anidulafungina (AND): S ≥0.016\ge 0.016, R < 0.016. Odczyt: 0.016 μg/ml0.016\,\mu\text{g/ml}.

    • Flukonazol (FL): S ≥2\ge 2, R < 4 (Odczyt 44 oznacza oporność).

    • Worykonazol (VO): S ≥0.06\ge 0.06, R < 0.25.

  • Doświadczenie siódme: Promieniowanie UV:

    • UV ma zdolność hamowania wzrostu drobnoustrojów przez uszkadzanie ich struktur (DNA).

    • Procedura:

      1. Wysianie murawy bakterii (E. coli lub S. aureus) z 24−h24-h hodowli płynnej na podłoże LA.

      2. Osłonięcie części agarowej papierowym kształtem.

      3. Ekspozycja otwartej płytki pod lampą UV przez 15 min15\,\text{min}.

      4. Inkubacja płytki przez 24 h24\,\text{h} w 37∘C37^\circ\text{C}.

      5. Wynik: Brak wzrostu w miejscach naświetlonych, wzrost w miejscach zasłoniętych papierem.