Chromosomenonderzoek erfelijkheidsleer

Chromosomenonderzoek

Cytogenetisch onderzoek (karyotypering)

Karyotypering wordt gedaan wanneer er een verdenking is op erfelijke aandoeningen. Dit kan zowel bij constitutionele (= in alle lichaamscellen) indicaties of maligniteiten (= tumorgroei). Het weefsel dat cytogenetisch wordt onderzocht moet niet-invasief zijn en in staat om te groeien in vitro. Vaak is dit postnataal weefsel zoals perifeer bloed of maligne cellen, soms is het prenataal weefsel zoals vruchtwatercellen. De makkelijkste beschikbare cellen zijn witte bloedcellen. Het is een onderzoek van het aantal en de structuur van de chromosomen.

1. Het bloedstaal wordt afgenomen met heparine (antistollingsmiddel). 2. Er wordt een chromosomencultuur aangelegd (37 graden voor 24-72 uur (afhankelijk van de deelsnelheid – kinderen met leukemie hebben hele kwetsbare cellen en chronische kankervormen delen heel langzaam) gestimuleerd door een stof genaamd PHA), dit wordt geïncubeerd. 3. Het bloedstaal wordt gecentrifugeerd. 4. Door de stof colchicine wordt voorkomen dat de spoeldraden worden gevormd tijdens de mitose waardoor de celdeling stopt in de metafase stadium. Daarnaast wordt een hypothonische behandeling gedaan (= het opzwellen van de cellen zodat de chromosomen beter gespreid kunnen worden). 5. Het bloedstaal wordt gecentrifugeerd. 6. Het bloedstaal wordt gefixeerd met een mix van methanol en azijnzuur om de eiwitten, rode bloedcellen en bloedplaatjes kapot te maken zodat er een preparaat gemaakt kan worden. Dit wordt drie keer gedaan. 7. De chromosomen worden gebandeerd (= de chromosomen kleuren zodat ze zichtbaar worden). 8. De chromosomen worden digitaal afgebeeld (digitale ordening van de chromosomen). 9. Er ontstaat een karyotype (chromosomenkaart).

Chromosomen moeten worden gebandeerd voordat een karyotype kan worden opgesteld.

• G (Giemsa) banding = meest frequent gebruikte techniek, waarbij de chromosomen eerst worden behandeld met trypsine om de chromosomale eiwitten die rond het DNA aanwezig zijn af te breken om vervolgens met Giemsa te kleuren. Hierdoor ontstaan lichte en donkere banden, waarbij donkere banden AT rijk zijn en lichte banden CG rijk zijn.

• Q banding = kleuring met quinacrine (fluorescerende kleurstof) waardoor een patroon ontstaat van heldere en doffe banden, waarbij heldere en doffe banden, waarbij de heldere banden AT rijk zijn en de doffe banden CG rijk. • R (reverse) banding = de chromosomen worden speciaal behandeld en gekleurd waardoor een karakteristiek patroon van lichte en donkere banden ontstaat. Gebruikt voor regio’s die moeilijk te kleuren zijn door G of Q banding. • C (centromeer) banding = kleuring van het centromerisch heterochromatine.

In de praktijk worden er van ieder weefsel 20 metafasen onderzocht door twee verschillende laboranten.

Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)

Techniek waarmee men de aan- of aanwezigheid van een specifieke DNA sequentie kan worden nagegaan. Het wordt vooral gebruikt bij diagnose van aandoeningen veroorzaakt door microdeletie en karakterisatie van structurele afwijkingen. Ook wordt het gebruikt als cytogenetisch onderzoek op niet-delende cellen.

Probe = een complementair, dubbelstrengig DNA fragment in een ‘vector’ uit bijvoorbeeld een e. coli bacterie.

Denaturatie = het scheiden van twee DNA strengen.

Hybridisatie = de probe toevoegen aan de chromosomen en kernen.

Er zijn verschillende soorten probes, gen of locus specifieke probes, een centromeer probe, telomeer probe of een probe waar het gehele chromosoom mee wordt gekleurd (‘painting’ probe of bank). Daarnaast zijn er verschillende varianten van de FISH procedure, 1-kleur FISH, 2-kleur FISH en multi-kleur FISH. Bij fiber FISH worden alle chromosomen gelyseerd (= kapot gemaakt) en wordt het DNA uit elkaar getrokken om te analyseren.

Ondiepe genoom sequenering (sWGS)

Techniek die gebruikt wordt om deleties en duplicaties in patiënten op te sporen.

1. Isoleren van DNA uit het weefsel van de patiënt. 2. Fragmenteren (= in stukken breken) van het DNA. 3. Stukjes DNA worden gekoppeld aan stukjes gekend DNA (library preparation) en vermeerderd (amplication). 4. Het next generation sequeneringstoestel leest de volledige volgorde van het DNA af.

Optische genoom mapping (OGM)

Techniek die gebruikt kan worden voor het opsporen van deleties, inversies, inserties maar ook gebalanceerde en ongebalanceerde translocaties. Voor deze techniek wordt er hoog moleculair gewicht DNA geïsoleerd uit het weefsel. Dit DNA wordt gekleurd, op een chip geladen en door smalle kanaaltjes geduwd zodat het rechtlijnig wordt. Ten slotte worden ze gevisualiseerd en uitgelezen door een computer algoritme.