Notes on Pseudomonas, Yeasts, Molds and Staphylococcus Aureus

Pseudomonas

• Bacilles Gram négatif, oxydase +.
• Aérobies stricts (Respiration nitrate chez certaines espèces).
• Peu exigeantes, cultivant à 30 °C.
• Indole -.
• Asporulés.
• Colonies souvent pigmentées.
• Ubiquitaires (++milieu humide).
• Agent de pus bleu, biodégradation.
• Commensales de l’homme et l’animal.
• Pathogènes opportunistes pour les immunodéprimés (Les fleurs).
• En plus petite quantité dans les eaux riches en matières organiques (en particulier les eaux stagnantes).
• Se retrouvent dans les siphons d'évier et les réservoirs d'eaux de pluie.

Recherche de Pseudomonas dans l’eau

• Deux méthodes:
  • Normalisée (pour les eaux de piscines ou de consommation).
  • Alternative: Filtration de 100 à 250 ml.

Méthode Normalisée

• Filtre, CN agar, 37°C, 44h (vérification après 22h et 44h).
• Colonies bleu vertes.
• Confirmation: repiquage sur gélose nutritive pour contrôler la pureté.
• Sous UV:
  • Si pas de pyocianine mais donnant fluorescence comme $P. aeruginosa$ (Type I).
  • Colonies brunes rougeâtre et ne donnant pas une fluorescence comme $P. aeruginosa$ (Type II).

Milieu CN

• Cétrimide ou bromure d’hexadécyltriméthyl ammonium: inhibiteur de G+ et G-.
• L’acide nalidixique (spectre étroit): inhibe les G- (entero).
• Sulfate de potassium et chlorure de magnésium: favorisent la production de la pigmentation.
• Repiquage sur bouillon acétamide:
  • Acétamide = unique source de C et N.
  • Après incubation 22h 36°C, rajouter réactif Nessler.
    • Virage de jaune vert le rouge indique la production de l’ammoniac à partir de l’acétamide.
• Repiquage sur milieu GN:
  • Oxydase -.
  • Oxydase +.
• Repiquage sur milieu KingB.
  • Fluorescente sous UV.
  • Virage de jaune au rouge: Caséine.

Milieu King B

• Incubation 24h jusqu’à 5 jours.
• Phosphate acide de potassium:
  • Permet d’inhiber la production de pyocianine.
• Sulfate de magnésium:
  • Active la production de pyoverdine.
  • La pyoverdine jaunit le milieu. Cette molécule présente une fluorescence à 340 nm.

Recherche de Pseudomonas dans les aliments

• Solution mère dilutions gélose Pseudo CFC ISO (0.1ml).
• Dénombrement des boites ne contenant pas plus de 150 colonies.
• Sélectionner 5 colonies sur chaque boite.
• Test oxydase.

Milieu Pseudomonas CFCISO

• Chlorure de magnésium.
• Sulfate de potassium.
• Cétrimide (antisépetique).
• Céfalotine: céphalosporine de 1 ere génération, inhibe les entero, staph, strepto.
• Fusidate de sodium: inhibe staph et strepto.

Recherche de Pseudomonas dans les produits pharmaceutiques

• Cétrimide (biomerieux ou chemunex).
• Cétrimide ou bromure d’hexadécyltriméthyl ammonium: inhibiteur de G+ et G-.
• L’acide nalidixique (spectre étroit): inhibe les G- (entero).
• Sulfate de potassium et chlorure de magnésium: favorisent la production de la pigmentation.
• Peptone de gélatine: faible teneur en cys et tryptophane.
• Colonies verdâtre ou grisâtre.
• 3 tests confirmatifs:
  • Culture à 42°C sur bouillon trycase soja.
  • Oxydase.
  • King A.
  • Production de pyocianine.

Recherche de Pseudomonas dans les produits cosmétiques

• Eugon LT100 + produit.
• Filtration.
• Déposer le filtre dans Eugon LT100: enrichissement 20h jusqu’à 72h.
• 0.1 ml sur milieu cétrimide.
• Colonies en vert + fluorescence sous UV.
• 3 tests confirmatifs:
  • Culture à 42°C sur bouillon trycase soja.
  • Oxydase.
  • King A et B.
• Galerie API si produit 1 ou 2.
• Agent neutralisant: lecithine, polysorbate 80, Tritonx 100.

Recherche des levures et moisissures dans les différents domaines

• Les champignons microscopiques comprennent:
  • Les levures (champignons unicellulaires).
  • Les moisissures (champignons filamenteux).

Caractéristiques

• Eucaryote.
• Constitués soit d'éléments unicellulaires, soit de filaments.
• Hétérotrophes.
• Résistent à des conditions environnementales très défavorables.
• Leur température optimale de croissance varie selon les espèces:
  • 25°C pour les champignons mésophiles.
  • 37°C pour les champignons thermophiles.
  • Les espèces pathogènes présentent un optimum de croissance à des températures comprises entre 30 et 45°C.
• Certaines moisissures peuvent produire des toxines via leur métabolisme secondaire, appelées « mycotoxines ».
• Dégradation de la qualité organoleptique des aliments est l’un des effets indirects connus de la présence de champignons, en raison de la production de métabolites secondaires.
  • Aspergillus niger, isolé de canalisations de distribution d’EDCH, a été à l’origine de mauvais goûts et odeurs (Ribeiro, 2006).
• Les moisissures et levures retrouvées dans les eaux conditionnées peuvent avoir pour origine:
  1. l’eau à l’émergence (la ressource).
  2. les contenants réutilisés, contaminés par de l’eau employée pour leur nettoyage.
  3. l'air au contact des matériaux ou de l’eau, lors du processus de conditionnement.

Milieux classiques pour la culture ou l’isolement des levures et moisissures

• Gélose à la pomme de terre.
• Gélose à l’extrait de malt.
• Gélose Sabouraud glucosé.
• Gélose Sabouraud.
• Gélose Sabouraud avec ATB.

Protocole de recherche et de dénombrement dans les aliments

• Milieu YGC (Yeast glucose chloramphénicol):
  • Extrait de levure, glucose, Chloramphénicol (ATB à large spectre), pH acide.
  • Contrôle du milieu avec Candida albicans et Saccharomyces cerevisiae.
  • Aspergillus niger et Penicillium cyclopium (3 à 5 jours d’incubation à 25°C).
  • E coli et Bacillus subtilis ne présentent aucune croissance.
• Gélose glucosé à l’oxytétracycline:
  • Extrait de levure, glucose, Oxytétracycline (ATB à large spectre de la famille de tétracycline).
• Isolement: PDA: Gélose à la pomme de terre
  • Geotrichum candidum et Aspergillus niger présentent une bonne croissance.

Agar au dichlorane glycerol: DG18

• Glycérol diminue l’AW. (Ajout de 175 ml de glycérols avant autoclavage).
• Dichlorane limite l’envahissement des moisissures (réduit la taille des colonies et facilite la numération).
• Chloramphénicol, pH acide
• Milieu sélectif à faible AW
• Isolement et dénombrement des champignons xérophiles (aliment séché).
• E coli et Bacillus subtilis
• Saccharomyces cerevisiae
• Mucor racemomus

Protocole de recherche et de dénombrement dans les produits pharmaceutiques

• Gélose Sabouraud glucosé:
  • Dénombrement dans les médicaments non stériles.
  • Recherche de Candida albicans.
• Gélose Sabouraud:
  • Isolement, identification et culture des champignons …
  • Contrôle de stérilité des produits pharmaceutiques.
  • Glucose à forte concentration, pH acide.
  • Peptone+glucose (on peut ajouter gentamicine ou chloramphénicol).
  • Nombre de colonie inférieur à 100: Dénombrer les boites entre 15 et 150 colonies.

Recherche et dénombrement dans les produits cosmétiques

• Gélose Sabouraud (isolement).
• OGA (dénombrement).

Recherche et dénombrement dans l’environnement hospitalier et industriel

• Environnement protégé.
  • Gélose Count-Tact Sabouraud glucosé chloramphénicol neutralisants irradiée.
  • Milieu contient 4 agents neutralisants qui inactivent les désinfectants résiduels: Lécithine, Polysorbate 80, thiosulfate de sodium, L- histidine.
  • Contrôle microbiologique des surfaces, l’air et du personnel.
    • A l’entré de la zone.
    • Dans un secteur fréquenter par le personnel.
    • Dans un secteur peu fréquenter par le personnel.
• Environnement non protégé.
  • Gélose Sabouraud glucosé chloramphénicol
  • Contrôle microbiologique de l’air et des gants ou doigts du personnel.

Identification de levures et moisissures

• EMB
  • Agar lactosé à l’éosine et au bleu de méthylène.
  • Eosine jaune et BM inhibent les B G+.
  • Lactose comme seule source de C.
  • Lecture après 3 à 4h.
  • Colonie en forme de toile d’araignée ou de plume.
• Gélose chromID Candida PCB:
  • Mélange d’ATB.
  • Substrat chromogène 1: hexosaminidase est hydrolysé pour donner coloration bleu à C albicans.
  • Substrat chromogène 2: Permet la coloration en rose des colonies d’autres espèces.
  • La Bile de bœuf inhibe les bactéries et certaines levures.
• Milieu Blastèse:
  • Carotte et pomme de terre favorisent la croissance de Candida albicans.
  • Milieu liquide. Permet la production de tubes germinatifs, caractéristiques de cette espèce (98% des souches).
  • Candida présente un pseudo- mycélium et des blastospores.
  • Candida albicans produit en plus des chlamydospores (spores épaisse).

Structures observées

• Filament
• Chlamydospores (spécifique de Candida albicans)
• Blastospores
• Levures bourgeonnantes
• Filaments porteurs d'amas de blastospores (genre Candida)
• Filaments porteurs de blastospores et chlamydospores (C albicans).
• Le tube germinatif de Candida albicans ne présente pas d'étranglement à sa base, contrairement au bourgeon habituel ou au pseudomycélium.

Auxanogramme du carbone

• Identification des levures ou des bactéries.
• Pour déterminer la capacité des micro-organismes à utiliser un glucide comme seule source de carbone, en condition aérobie
• Ensemencement:
  • Réaliser une suspension de la culture de levure.
  • Pour ensemencer, on peut:
    • Soit directement incorporer la suspension dans le milieu pour auxanogramme (10 gouttes pour 20mL de milieu) puis couler en boîte de Pétri (technique la plus efficace).
    • Soit 0,1mL sont étalés à la surface la boîte.
  • On ajoute ensuite les sources de carbone:
    • Soit sous forme de disques pré-imprégnés de molécules carbonées diverses (glucides mais aussi acides organiques, …).
    • Soit en déposant les solutions de molécules carbonées directement dans des puits creusés dans la gélose.
    • Les disques, comme les puits, doivent être distants d'au moins 15 mm.
  • Sucres à tester: glucose, maltose, saccharose, galactose, lactose, raffinose.
  • Incuber 24 à 48h à 30°C.
  • Lecture: Lorsque le sucre est utilisé, il se forme une zone de croissance autour du disque ou du puits.

Zymogramme du carbone - Sur milieu CTA

• Utilisation:
  • Identification des levures ou des bactéries.
  • Pour déterminer la capacité des micro-organismes à fermenter un glucide, en condition anaérobie.
• Milieu en surfusion, additionner une solution de glucide 2%. Laisser refroidir.
• Sucres à tester: glucose, maltose, saccharose, galactose, lactose, raffinose.
• Ensemencement:
  • Ensemencer par piqûre centrale avec une pipette bien chargée en culture et en prenant soin d'aller jusqu'au fond du tube.
  • Incuber 24 à 48h à 30°C.
• Lecture:
  • La fermentation du glucide se traduit par:
    • La formation de bulles de gaz à l'intérieur de la gélose.
    • Le virage au jaune de l'indicateur de pH, dû à l'acidification du milieu.

Recherche de Staphylococcus aureus dans les différents domaines

• Cocci Gram positif en amas ou diplocoques.
• Facultative anaerobe so can grow under both aerobic and anaerobic conditions.
• Resistant to adverse conditions such as low aw, high salt content and osmotic stress.
• Certains Staphylococcus produisent des toxines et peuvent être responsables de divers syndromes, par exemple des intoxications alimentaires.
• Staphylocoque coagulase positif: S. aureus.
• Staphylocoque coagulase Négatif: nombreuses espèces.

Coagulase Test

• Coag + : Staphylococcus aureus.
• Coag - : Coagulase negative staphylococci, e.g. S. epidermidis.
• Staphylocoque coagulase positif: = Staphylococcus aureus
  • Facilement identifiable par des kits d’agglutination (CF, Proteine A,..).
  • Virulence +++.
  • Sécrétion d ’enzymes (Coagulase libre, liée, DNAse), et de Toxines (entérotoxines, PVL).
  • Responsable d’infections communautaires ou nosocomiales.
• Désoxyribonucléase: DNASE
  • $ADN + H_2O \longrightarrow Nucléotides \text{ et/ou } polynucléosides$
  • Présence d’un halot clair autour de la strie: DNASE +.
  • Absence d’un halot autour de la strie: DNASE -.
  • Incubation 24h à 37°C.
• Présence d’une hémolysine (lyse hématies).
  • Test: On utilise une gélose au sang, on réalise une strie longitudinale.
  • Résultat:
    • Zone verdâtre autour de la strie: Hémolyse α.
    • Auréole claire autour de strie: Hémolyse .
    • Aucune réaction: pas hémolyse.
• Staphylocoque coagulase négatif: = nombreuses espèces
  • (S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. capitis,…).
  • Beaucoup moins virulent, responsable d’infections nosocomiales.
  • Identification biochimique si rôle possible dans une infection.
• Tableau clinique
  • Staphylococcus aureus cause principalement des infections de la peau et des tissus mous: abcès, furoncle, folliculite, impétigo, cellulite.
  • Staphylococcus aureus peut également causer des infections profondes: endocardite, pneumonie nécrosante, bactériémie, méningite, arthrite septique et infections des os, des articulations et des organes.
  • Plus rarement, il est responsable de syndromes liés aux effets des toxines produites par la bactérie, par exemple le syndrome du choc toxique et l’intoxication alimentaire.

Protocole de recherche et de dénombrement dans les aliments

• Deux méthodes:
  • Normalisée.
    • Sans enrichissement: recherche et dénombrement.
      • Gélose Baird Parker.
      • Confirmation: Coagulase Gélose au plasma de lapin et au fibrinogène.
      • Recommander pour certains produits: Fromage au lait cru.
    • Sans Confirmation.
  • Alternative.

Milieu Baird parker

• Chlorure de lithium: inhibe les G-.
• Tellurite de potassium: inhibe les G+, il est réduit en tellure métallique.
• Riche en peptone, pyruvate, glycine: stimulent la croissance de staph ayant subit des altérations lors de processus de fabrication des aliments .
• Jaune d’œuf.

Lecture du milieu de Baird Parker

• Milieu Baird parker pour coagulase positive, il met en évidence la lécithinase et la lipoprotéinase
  • Test: à partir d’une culture de 24h ensemencé les BP par strie (incuber 24h à 37°C)
  • Résultat:
    • colonie noire : réduction du téllurite en téllure.
    • halo claire : présence d’une lypoprotéinase
    • précipité blanc : hydrolyse des lécithines par lécithinase ( après 48h, opacification dans l’halo clair)
  • Les staphylocoques coagulase + sont lécithinase + et protéolyse+.

Milieu Baird parker au plasma et fibrinogène : RPF

• Il permet d’effectuer le test de coagulase libre
  • Fibrinogène bovin (protéine du plasma) intensifie la réaction de coagulase.
  • Inhibiteur de trypsine empêche la fibrinolyse totale ou partielle des halos formés autour des colonies à coagulase positif.
  • Lecture après ensemencement en surface ou en masse.
  • Colonie noir entourée d’un halo opaque

Enrichissement sélectif

• Gioliti Cantoni
• Gélose Baird Parker
• Gélose au plasma de lapin et au fibrinogène:RPF
  • Chlorure de lithium: inhibe les G-.
  • Tellurite de potassium: inhibe les G+, il est réduit en tellure métallique.
  • Tweeen 80: neutralisant d’antiseptique
  • Huile de paraffine: inhibe la culture des microcoques.
  • NB: méthode NPP pour le dénombrement, prendre les tubes ayant noircis

Alternative

• Gélose rapid staph
• Gélose BP optimiser
  • En +, sulfaméthazine, inhibe les Proteus
  • Après ensemencement et incubation 24h.
    • Colonies noires avec halo clair
    • Confirmation ( 3 colonies)
      • Test slidex
      • Par spot sur BPF ( jusqu’à 12 colonies par boite)
      • Le Slidex Staph-Kit est un test combiné de latex et d'hémagglutination pour la détection du facteur d'agglutination, de la protéine A et d'autres antigènes spécifiques des souches de Staphylococcus aureus.

Protocole de recherche et de dénombrement dans l’eau

• Filtration: eau de consommation, de piscine, établissement de soin
  • BP
  • Confirmation par coagulase
  • Chapman
  • BPF
  • Incubation à37°C pendant 48h

MILIEU CHAPMAN

• Milieu d'isolement sélectif des bactéries du genre Staphylococcus (coques Gram + regroupés en amas)
• Lecture
  • Présence ou absence de culture (colonies)
    • Présence présomption des bactéries du genre Staphylococcus (uniquement présomption car les milieux ne sont pas sélectifs à 100%).
    • Absence: les bactéries étudiées ne sont pas des bactéries du genre Staphylococcus.
  • Couleur des colonies
    • Colonies jaunes : Utilisation du mannitol par les bactéries. Elles sont dites mannitol +.
    • Colonies rouges : Absence d'utilisation du mannitol par les bactéries. Elles sont dites mannitol -.

Protocole de recherche dans les produits cosmétiques

• Eugon LT100 + produit
• 20h à 37°C
• 0.1 ml sur milieu BP
• Colonies noires avec un halo clair
• Confirmation
  • Vérifier la pureté Gram
  • Coagulase
  • Galerie API peut être effectuer
• Incubation 24h-48h à 37°C
• Catalase
• Souche pure, G+, Cat+, Coag+: staph dorée

Protocole de recherche dans les produits pharmaceutiques

• Produit non obligatoirement stérile
• Confirmation
  • API 20 STAPH
  • BP
  • Chapman

Protocole de recherche dans l’environnement Hospitalier Industriel

• Chez les patients hospitalisés, le Staphylococcus aureus, dont le SARM, est le principal responsable de plusieurs types d’infections nosocomiales, notamment des infections de plaies post-opératoires ou de cathéter, des pneumonies et des septicémies.
• Boite count tact chapman
• Gélose Chrom ID MRSA.SA: coloration verte
• Ensemencement direct
• Enrichissement
  • Bouillon cœur cervelle (18h) 24 à 48h
  • 24h
  • Confirmation par test biochimique ou immunologique, puis antibiogramme : methicilline
• thermonucléase
  • Chauffage 15min - 100°C
  • B cœur cervelle (24h- 37°C)
  • Milieu ADN+BLEU de toluidine
  • Laisser refroidir

IDENTIFICATION DES COCCI GRAM+

• Schématiquement les cocci Gram positif peuvent se classer ainsi:

Cocci Gram positif

Catalase +

• Oxydase+
  • Micrococcus
• Oxydase-
  • Résistant au NaCl 6,5%
    • Staphylococcus
    • Stomatococcus
  • Non résistant au NaCl 6,5%
    • Vancomycine: S
      • Pousse à 10°C
        • Pediococcus
      • Ne pousse pas à 10°C
        • Leuconostoc
    • Vancomycine: R
      • Lactococcus

Les Cocci à Gram+

Morphologie: En amas

• Genre
  • Staphylococcus
    • Espèce: aureus
      • Nom courant: dorée
      • Habitat: peau
      • Pouvoir pathogène: suppuration
    • Espèce: epidermidis
      • Nom courant: blanc
      • Habitat: A, C, G
      • Pouvoir pathogène: -
        Morphologie: En chaînettes
• Genre
  • Streptococcus
    • Espèce: Bêta hémolytique
      • Habitat: muqueuses, pharynx
      • Pouvoir pathogène: Angines, synd.post-streptococcique
    • Espèce: B
      • Habitat: voies génitales
      • Pouvoir pathogène: infections néonatales
    • Espèce: D
      • Habitat: intestin
      • Pouvoir pathogène: inf. urinaire, digestive endocardites
        Morphologie: Diplocoques
• Genre
  • Streptococcus pneumoniae
    • Nom courant: pneumocoque
    • Habitat: voies respiratoires
    • Pouvoir pathogène: pneumonies, méningites