Molecular Biology Flashcards - DNA Structure and Function

BIOLOGIA MOLECOLARE: DNA E STORIA DELLA RICERCA

  • Definizione: Acido deossiribonucleico.
    • Proprietà Chimiche: Molecola carica negativamente, acido, contenente lo zucchero deossiribosio.
    • Funzione: Molecola informazionale presente in tutti gli organismi e in molti virus (alcuni virus usano l'RNA, che è nato evolutivamente prima del DNA).
  • Tappe Storiche della Scoperta:
    • Miescher (1869): Studiò i leucociti isolando una sostanza nel nucleo che chiamò Nucleina, contenuta nei nucleosomi. Notò la sua presenza in tutte le cellule, non solo umane.
    • Griffith (1928): Esperimento sullo Streptococco. Identificò il ceppo R (non virulento) e il ceppo S (virulento/capsulato). Scoprì che una miscela di ceppo S ucciso dal calore e ceppo R vivo causava la morte dei topi; ipotizzò l'esistenza di un "principio trasformante".
    • Avery, MacLeod e McCarty (1944): Dimostrarono che la trasformazione dei ceppi batterici avveniva solo aggiungendo DNA, identificando quest'ultimo come materiale genetico.
    • Hershey e Chase (1952): Esperimento definitivo con batteriofagi. Marcarono il DNA con fosforo radioattivo (^{35}P) e le proteine con zolfo radioattivo (^{35}S). Dimostrarono che solo il DNA entra nel batterio per l'infezione.
    • Watson e Crick (1953): Definizione della struttura a doppia elica in contemporanea con gli studi di Franklin e Wilkins.

I NUCLEOTIDI: COMPOSIZIONE E FUNZIONE

  • Struttura: Composti da una base azotata, uno zucchero pentoso e uno o più gruppi fosfato.
    • Nucleoside: Base azotata + Zucchero.
    • Nucleotide: Nucleoside + Gruppo/i fosfato (Mono, Di o Trifosfati).
  • Funzioni Secondarie: Fonte energetica (ATP), componenti di cofattori (FAD, NAD, CoA), messaggeri chimici (AMP ciclico) e assorbimento luce UV.
  • Le Basi Azotate:
    • Purine (2 anelli, 5C e 4N): Adenina (A) e Guanina (G). Atomi di N in posizione 1, 3, 5, 7.
    • Pirimidine (1 anello, 4C e 2N): Citosina (C), Timina (T) e Uracile (U). Atomi di N in posizione 1, 3.
  • Caratteristiche Chimiche Specifiche:
    • Adenina: Gruppo amminico in posizione 6.
    • Timina (DNA): 2,4-diosso-5-metilpirimidina. Ha un gruppo metilico in posizione 5.
    • Uracile (RNA): 2,4-diossipirimidina.
    • Guanina: 2-ammino-6-idrossipurina.
    • Citosina: 4-ammino-2-idrossipirimidina.

TAUTOMERIA E PROPRIETÀ DELLE BASI

  • Tautomeria: Isomeri in equilibrio che differiscono per la posizione dell'atomo di idrogeno. Diversa dalla risonanza (che riguarda gli elettroni).
    • Cheto-enolica (U, G, T): La forma chetonica è la più stabile.
    • Ammino-imminica (C, A): Spostamento di H tra gruppi amminici e azoti dell'anello.
  • Assorbimento UV: Le basi assorbono i raggi UV; questo può causare danni come i dimeri di timina, ma è utile per il sequenziamento.
  • Stabilità: Il DNA è più stabile dell'RNA perché quest'ultimo ha un ossidrile (OH) in posizione 2' che lo rende suscettibile ad attacco nucleofilo.

LO ZUCCHERO E IL LEGAME FOSFODIESTERICO

  • Pentoso: Monosaccaride a 5 atomi di carbonio (C{5}H{10}O_{5}).
    • Proiezioni di Haworth: Struttura non planare. Carbonio anomerico C1 lega la base. Il C2 distingue Ribosio (con OH) e Deossiribosio (con H).
    • Conformazioni: Endo (atomo sullo stesso piano del C5) o Eso (piano opposto).
  • Legami:
    • N-Glicosidico: Tra C1 dello zucchero e azoto della base.
    • Fosfoestere: Tra fosfato e C5 dello zucchero.
    • Fosfoanidridico: Tra gruppi fosfato (\alpha, \beta, \gamma), ad alto contenuto energetico.
    • Fosfodiesterico: Lega i nucleotidi tra loro nel polimero; il fosfato conferisce carica negativa alla molecola (acidi deboli).

COFATTORI E NUCLEOTIDI SPECIALI

  • ATP: Principale fonte energetica; concentrazione cellulare bassa (\approx 35 MM).
  • GTP: Interviene nella sintesi proteica e attivazione proteine G. Convertibile in ATP tramite nucleoside bifofato chinasi.
  • FAD: Coenzima ossidoriduttivo (Flavin-Adenin-Dinucleotide). Deriva dalla Vitamina B2.
  • NAD: Formato da AMP e nicotinammide mononucleotide. Il NADP è la versione fosforilata.
  • Acetil-CoA: Struttura base adenosina 3'-fosfato legata a acido pantotenico e beta-mercaptoetilammina.
  • cAMP: Adenosina 3',5'-monofofato ciclico. Secondo messaggero attivato dall'adenilato ciclasi (stimolata da proteine G) in risposta a ormoni (Adrenalina).

STRUTTURA SECONDARIA DEL DNA: LA DOPPIA ELICA

  • Regole di Chargaff: In ogni specie, la quantità di Purine = Pirimidine. (A = T) e (G = C). Il rapporto (A+T)/(G+C) è variabile tra le specie.
  • Modello Watson e Crick: Due filamenti antiparalleli (5' \rightarrow 3' e 3' \rightarrow 5'). Scheletro idrofilo (zucchero-fosfato) esterno, basi idrofobiche interne.
  • Appaiamenti: A-T (2 legami H), G-C (3 legami H). Maggiore è il contenuto di G-C, maggiore è la temperatura di fusione (Tm).
  • Parametri della Doppia Elica:
    • Distanza tra le basi: 0.34 \AA (0.34 nm).
    • Un giro d'elica: 3.4 nm (10 coppie di basi).
    • Diametro: 2 nm (20 \AA).
  • Solchi: L'ingombro sterico e l'asimmetria creano un Solco Maggiore e un Solco Minore.

CONFORMAZIONI DEL DNA

  • Forma B: La più comune in condizioni fisiologiche (pH 7). Destrorsa, basi perpendicolari all'asse.
  • Forma A: Tipica dell'RNA a doppia elica o DNA deidratato. Più larga e corta. Basi inclinate.
  • Forma Z: Sinistrorsa, struttura a zig-zag. Si forma in zone con alternanza purine-pirimidine e alta concentrazione salina.
  • Eliche Speciali: Tripla elica (appaiamenti di Hoogsten) e Quadrupla elica (G-quadruplex, tipiche dei telomeri).

DENATURAZIONE E RINATURAZIONE

  • Denaturazione: Separazione dei filamenti per calore. Fenomeno cooperativo (effetto domino).
  • Effetto Ipercromico: Aumento del 40\% dell'assorbimento UV a 260 nm durante la denaturazione.
  • Curva Cot: Analisi della riassociazione del DNA in funzione di concentrazione e tempo (\log Cot). Dipende dalla complessità del genoma e dalla presenza di sequenze ripetute.
  • Stabilità: Forze di impilamento (stacking) tra le basi contribuiscono più dei legami H.

STRUTTURA TERZIARIA E TOPOLOGIA

  • Superavvolgimento: Necessario per compattare il DNA (nell'uomo 2 m di DNA in una cellula). Tipico di DNA circolare (batteri, mitocondri).
  • Numero di Legame (Lk): Lk = Tw + Wr.
    • Tw (Twist): numero di giri di un filamento sull'altro.
    • Wr (Writhe): contorcimento dell'asse della doppia elica (Interwound o Toroide).
  • Topoisomerasi:
    • Tipo I: Taglia un solo filamento, non richiede ATP. Cambia Lk di 1.
    • Tipo II: Taglia entrambi i filamenti, richiede ATP. Cambia Lk di 2. Esempio: Girasi batterica.

ORGANIZZAZIONE DELLA CROMATINA NEGLI EUCARIOTI

  • Definizione: Complesso di DNA e proteine (Istoni e Non Istoniche).
  • Istoni: Proteine basiche cariche positivamente (ricche di Arginina e Lisina).
    • Core Istonico: Ottamero formato da due dimeri (H2A-H2B) e due tetrameri (H3-H4).
    • Istone H1: Istone linker, stringe il DNA all'ingresso/uscita dal nucleosoma.
  • Unità Strutturali:
    • Nucleosoma: 147-164 bp di DNA avvolti attorno all'ottamero.
    • DNA Linker: Tratto libero tra nucleosomi (20-60 bp).
    • Fibra da 10 nm: Modello a "filo di perle".
    • Fibra da 30 nm: Modello a solenoide (6 nucleosomi per giro).
  • Stadi di Condensazione:
    • Eucromatina: Meno compatta, trascrizionalmente attiva.
    • Eterocromatina: Molto compatta, inattiva. Può essere Costitutiva (centromeri) o Facoltativa (es. Corpo di Barr).

RIMODELLAMENTO E CODICE ISTONICO

  • Complessi di Rimodellamento: Esempio SWI/SNF. Usano ATP per lo scivolamento del nucleosoma o cambiamenti conformazionali.
  • Modificazioni Epigenetiche (Code N-terminali):
    • Acetilazione (Lisina): Riduce la carica positiva, rilassa la cromatina (Attivazione).
    • Metilazione (Lisina/Arginina): Può attivare o reprimere.
    • Fosforilazione (Serina): Coinvolta nella condensazione mitotica.
  • Proteine Lettrici: Bromodomini (riconoscono acetilazione), Cromodomini (riconoscono metilazione).
  • Epigenoma: Informazione ereditabile non contenuta nella sequenza del DNA.

REPLICAZIONE DEL DNA

  • Meccanismo: Semiconservativo (confermato dall'esperimento di Meselson e Stahl con $^{15}N$).
  • Direzione: Sempre 5' \rightarrow 3'.
  • Enzimi Procariotici (E. coli):
    • DNA Pol III: Principale replicasi, alta processività. Complesso con sliding clamp e caricatore della pinza.
    • DNA Pol I: Rimuove inneschi RNA (attività esonucleasica 5' \rightarrow 3') e riempie i gap.
    • DNA Pol II: Riparazione.
    • Elicasi (DnaB): Srotola l'elica.
    • Primasi (DnaG): Sintetizza piccoli primer di RNA.
  • Fasi:
    • Inizio: Avviene all'Origine (oriC). Proteine DnaA denaturano regioni ricche di A-T.
    • Allungamento: Semidiscontinuo. Filamento Guida (continuo) e Filamento Lento (discontinuo tramite Frammenti di Okazaki).
    • Termine: Proteine Tus legano siti Ter bloccando la forca.

REPLICAZIONE NEGLI EUCARIOTI E TELOMERI

  • Fase S: Più origini di replicazione (Replicone). Controllata da chinasi Cdk/Ddk.
  • Polimerasi Eucariotiche:
    • Pol \alpha: Inizio/Primasi.
    • Pol \delta / \epsilon: Allungamento (leading e lagging).
    • PCNA: Versione eucariotica della sliding clamp.
  • Telomeri e Telomerasi: I telomeri presentano sequenze ripetute (uomo: TTAGGG). La Telomerasi è una trascrittasi inversa (TERT) con un modulo a RNA (stampi) che allunga le estremità sporgenti 3' per evitare l'accorciamento dei cromosomi. Forma strutture protettive T-loop.

TRASCRIZIONE: DAL DNA ALL'RNA

  • Generalità: Sintesi di RNA in direzione 5' \rightarrow 3' usando un filamento stampo.
  • Procarioti:
    • Oloenzima: Core (2\alpha, \beta, \beta', \omega) + Fattore \sigma.
    • Fattore \sigma: Riconosce il promotore (sequenze -35 e -10). \sigma^{70} è quello standard.
    • Terminazione: Rho-indipendente (forcina G-C seguita da poli-U) o Rho-dipendente (proteina Rho con attività elicasica).
  • Eucarioti:
    • RNA Pol I: Trascrive rRNA 45S (nucleolo).
    • RNA Pol II: Trascrive mRNA e alcuni snRNA. Ha una coda CTD (carbossi-terminale) fondamentale per la maturazione.
    • RNA Pol III: Trascrive tRNA e rRNA 5S.
    • Promotore Pol II: Contiene TATA box (-30), Inr, BRE, DPE. Richiede Fattori Generali (TFIIA, B, D, E, F, H) e il Complesso del Mediatore.

MATURAZIONE DELL'mRNA (EUCARIOTI)

  1. Capping al 5': Aggiunta di 7-metil-guanosina tramite legame 5'-5'. Funzione: protezione e inizio traduzione.
  2. Poliadenilazione al 3': Aggiunta della coda di Poli(A) (50-250 A) dopo il segnale AAUAAA. Funzione: stabilità, esporto nucleare.
  3. Splicing: Rimozione degli introni e unione degli esoni.
    • Spliceosoma: Complesso di snRNP (U1, U2, U4, U5, U6).
    • Meccanismo: Due reazioni di transesterificazione che formano una struttura a cappio (Lariat).
    • Splicing Alternativo: Un singolo gene produce proteine diverse includendo/escludendo esoni (es. tropomiosina, Dscam).
  4. RNA Editing: Modifica post-trascrizionale di basi (C \rightarrow U nell'Apolipoproteina B o A \rightarrow I tramite enzimi ADAR).

TRADUZIONE: SINTESI PROTEICA

  • Codice Genetico: A triplette (codoni). 64 codoni: 61 per amminoacidi, 3 di Stop (UAG, UGA, UAA). Degenerato, universale, non sovrapposto.
  • tRNA: Struttura a trifoglio, braccio dell'anticodone e sito di legame per aa (estremità 3' CCA).
  • Amminoacilazione: Enzimi amminoacil-tRNA sintetasi caricano l'aa sul tRNA consumando ATP.
  • Ribosoma: Siti A (amminoacidico), P (peptidilico), E (exit).
  • Fasi della Traduzione:
    • Inizio (Procarioti): Richiede sequenza Shine-Dalgarno e N-formilmetionina. Fattori IF1, IF2, IF3.
    • Inizio (Eucarioti): Riconoscimento del Cap, scansione della sequenza di Kozak, tRNA iniziatore porta Metionina.
    • Allungamento: Inserimento del tRNA (EF-Tu/eEF1), formazione legame peptidico (peptidil-trasferasi), traslocazione (EF-G/eEF2).
    • Terminazione: Fattori di rilascio (RF) riconoscono i codoni di stop e idrolizzano la catena proteica.

REGOLAZIONE GENICA E OPERONI (BATTERI)

  • Operone Lac: Sistema inducibile. In assenza di lattosio, il repressore blinda l'operatore. Il lattosio (allolattosio) funge da induttore disattivando il repressore. Richiede attivazione positiva da CAP-cAMP quando il glucosio è basso.
  • Operone Trp: Sistema reprimibile. Il triptofano funge da co-repressore.
    • Attenuazione: Meccanismo basato sulla velocità di traduzione della sequenza leader che forma strutture di terminazione dell'RNA se il triptofano è abbondante.

RNA NON CODIFICANTI DI REGOLAZIONE

  • miRNA: Piccoli RNA (22 nt) che silenziano post-trascrizionalmente l'mRNA tramite il complesso RISC.
  • siRNA: Coinvolti nell'RNA interference (difesa virale).
  • lncRNA: Più lunghi di 200 bp. Regolano la cromatina (es. Xist per l'inattivazione del cromosoma X) o agiscono da decatatori (spugne) per i miRNA.
  • circRNA: RNA circolari molto stabili, regolano i miRNA.
  • piRNA: Proteggono le cellule germinali dai trasposoni.

BIOLOGIA COMPUTAZIONALE E TECNICHE

  • Banche Dati: NCBI (GenBank, PubMed, BLAST per similarità), UniProt (Proteine).
  • PCR: Reazione a catena della polimerasi per amplificare il DNA. Richiede primer, Taq polimerasi, dNTP e cicli di temperatura.
  • Elettroforesi: Separazione di molecole per carica e massa su gel di agarosio (DNA/RNA) o poliacrilammide (proteine - SDS PAGE).
  • Blotting: Southern (DNA), Northern (RNA), Western (Proteine).
  • Organismi Modello: Lievito, Drosophila, Zebrafish, Topo, C. elegans.