Bacteriology Notes

Os caminhos de degradação da glicose: Oxidativo vs. Fermentativo (Teste de Hugh e Leifson)

O teste de Hugh e Leifson diferencia entre os caminhos de degradação de glicose oxidativa e fermentativa.

Preparação do Meio:

Composição do Meio de Hugh e Leifson:

• Peptonas: 2.0gm/L
• Cloreto de Sódio: 5.0gm/L
• Fosfato de Dipotássio: 0.30gm/L
• Glicose (Dextrose): 10.0gm/L (1% de concentração adicionada aos tubos)
• Azul de Bromotimol: 0.030gm/L
• Ágar: 3.0gm/L
• Água Destilada: quantidade suficiente para trazer a 1000 mL
• pH: 7.1 \'pm 0.2 a 25°C

Procedimento:

1. Derreta o meio em um banho-maria a 100°C.
2. Mantenha o meio derretido em um banho-maria a 45°C.
3. Adicione a solução de glicose a uma concentração final de 1% em dois tubos.
4. Deixe o meio solidificar em gelo.

Cepas Bacterianas para Teste:

• Escherichia coli (E. coli)
• Proteus sp.
• Pseudomonas aeruginosa
• Acinetobacter sp.

Inoculação:

1. Umedeça uma alça na suspensão microbiana.
2. Inocule o meio de Hugh e Leifson com uma estocada central.
3. Sobreponha um tubo com 0.5-1 ml de parafina líquida.
4. Incube a 37°C por 24 horas.
5. Mantenha um tubo semi-tampado.

Controles:

• Controle do meio (não inoculado).
• Controle sem glicose.

Interpretação dos Resultados:

• Ambos os tubos verdes (controle do meio): Nenhuma utilização de glicose.
• Ambos os tubos verdes e azuis (sem glicose, inoculado): Nenhuma utilização de glicose.
• Tubo com parafina verde, outro tubo amarelo: Utilização oxidativa de glicose.
• Ambos os tubos amarelos: Utilização fermentativa de glicose.

Resultados Esperados:

• Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter sp.: Aeróbios estritos, utilizam glicose de forma oxidativa.
• E. coli e Proteus sp.: Anaeróbios facultativos, utilizam glicose de forma fermentativa.

Influência do Oxigénio no Crescimento Bacteriano

Aeróbio (Estrito):

• Crescimento apenas na superfície.

Anaeróbio Facultativo:

• Crescimento em todo o meio, mas mais na superfície.

Anaeróbio Aerotolerante:

• Crescimento uniformemente ao longo do meio.

Anaeróbio Estrito:

• Crescimento apenas no fundo do meio.

Microaerófilo:

• Sem crescimento na superfície.
• Crescimento abaixo da superfície.

Teste de Catalase

Reação da Catalase: A enzima catalase converte peróxido de hidrogénio (H2O2) em água (H2O) e oxigénio (O2): 2H2O2 {(Catalase)} \rightarrow 2H2O + O2

Bactérias positivas para catalase produzem bolhas de oxigénio quando o peróxido de hidrogénio é adicionado.

Respiração Anaeróbica de Nitratos

Protocolo de Inoculação:

1. Use um pipeta de Pasteur para remover cultura do meio líquido.
2. Introduza a pipeta na parte inferior do ágar semi-sólido com e sem nitratos.
3. Crie estrias serrilhadas enquanto sobe.
4. Perto da superfície, faça uma estria vertical ao longo do meio.
5. Deixe o ágar solidificar.
6. Incube a 37°C por 24-48 horas.
7. Refrigere os tubos em gelo por 10-15 minutos até ficarem frios.

Resultados e Interpretação Esperados:

• Pseudomonas aeruginosa:
  • Crescimento apenas na superfície na ausência de nitrato.
  • Crescimento em todo o meio com bolhas de gás (N_2) quando o nitrato está presente.
• Proteus mirabilis:
  • Crescimento em todo o meio com e sem nitratos.
• Escherichia coli:
  • Crescimento em todo o meio na ausência de nitrato.
  • Crescimento em todo o meio com bolhas de gás (H_2) quando o nitrato está presente.

Caminho de Redução de Nitratos:

• O nitrato (NO3) é reduzido a nitrito (NO2) via redutase de nitrato.
• O nitrito é reduzido ainda mais a amónia (NH_4) via redutase de nitrito.
• Desnitrificação: O nitrito também pode ser reduzido a óxido nítrico (NO), óxido nitroso (N2O) e azoto molecular (N2).

Resumo dos Resultados:

Propriedades Hidrolíticas dos Micro-organismos

Testes para a degradação de amido, proteínas, lipídios, DNA e fosfatos.

Hidrólise de Amido

Inoculação:

1. Divida um prato de ágar de amido em seções iguais.
2. Estrie o centro de cada seção com o micro-organismo correspondente (Bacillus cereus, E. coli, Pseudomonas aeruginosa).
3. Incube a 37°C por 24-48 horas.

Revelação:

• Inunde a superfície com iodo de Lugol.

Resultados:

• Hidrólise Positiva: Halo claro ao redor das colónias onde o amido foi hidrolisado; o restante do meio fica azul escuro.
• Hidrólise Negativa: Sem zona clara; todo o meio fica azul.

Hidrólise de Proteínas (Caseína)

Inoculação:

1. Divida um prato de ágar de leite em quatro seções iguais.
2. Estrie o centro de cada seção com o micro-organismo correspondente (Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Serratia).
3. Incube a 37°C por 24-48 horas.

Resultados:

• Hidrólise Positiva: Halo claro ao redor da colónia onde a caseína foi hidrolisada.
• Hidrólise Negativa: Sem zona clara ao redor da colónia.

Hidrólise de Lipídios

Inoculação:

1. Divida um prato contendo lipídios (por exemplo, com Tween 80 e cálcio) em quatro seções.
2. Estrie o centro de cada seção com o micro-organismo correspondente (E. coli, S. aureus, Serratia, B. cereus).
3. Incube a 37°C por 24-48 horas.

Resultados:

• Hidrólise Positiva: Halo opaco forma ao redor da colónia devido à libertação de ácidos graxos.
• Hidrólise Negativa: Sem zona opaca ao redor da colónia.

Hidrólise de DNA

Inoculação:

1. Divida um prato de ágar de DNA em quatro seções.
2. Estrie cada seção com S. aureus, S. epidermidis, Serratia e E. coli.
3. Incube à temperatura ambiente por 24-48 horas.

Revelação:

• Inunde a superfície com 1N HCl.
• Aspire o excesso de HCl após 5-10 minutos.

Resultados:

• Hidrólise Positiva: Halo transparente ao redor da colónia devido à degradação do DNA; o restante do meio permanece opaco.
• Hidrólise Negativa: Sem halo transparente.

Hidrólise de Fosfato (Teste de Fosfatase Alcalina)

Teste de atividade de fosfatase alcalina com S. epidermidis, S. aureus, E. coli e Serratia.

Resumo das Atividades Hidrolíticas

Chave:

• (+): Positivo para hidrólise
• (-): Negativo