Untitled

Metody hodowli drobnoustrojów

Podłoża hodowlane

  • Podłoża (pożywki) wykorzystywane do:
    • wykrywania mikroorganizmów
    • namnażania
    • identyfikacji w warunkach in vitro
  • Skład:
    • mieszaniny dobranych składników
    • odpowiednie związki odżywcze pozwalają na wzrost różnych rodzajów mikroorganizmów
  • Rodzaje podłoży:
    • płynne (brak czynnika zestalającego)
    • stałe (zawierają 1-2% agar)

Przygotowanie podłoży

  • Podłoża przygotowuje się w laboratoriach mikrobiologicznych:
    • z poszczególnych komponentów (mówiąc o składzie ilościowym)
    • częściej z gotowych podłoży sprzedawanych w postaci sproszkowanej przez firmy biotechnologiczne
  • Każde podłoże dostarczane jest z atestem jakościowym oraz certyfikatem żyzności czy wybiórczości
  • Łatwe w użyciu podłoża rozprowadza się na:
    • płytkach Petriego
    • w sterylnych butelkach lub probówkach

Cechy prawidłowego podłoża

  • Odpowiedni skład:

    • źródła pierwiastków biogennych
    • węgiel, azot, wodór, tlen, fosfor, siarka
    • źródła energii
    • sole mineralne (sód, wapń, potas)
    • mikroelementy (mangan, cynk, miedź, molibden)
    • substancje wzrostowe (aminokwasy, witaminy)

  • Izotoniczność:

    • NaCl dodawany do uzyskania ciśnienia osmotycznego zbliżonego do komórki
    • Konsekwencje:
    • Hipotoniczne podłoże => pęcznienie i pękanie komórek
    • Hipertoniczne podłoże => kurczenie się plazmy komórkowej (plazmoliza)
    • Rysunek 1: Komórka w różnych środowiskach

  • Przejrzystość (z wyjątkiem podłoży z nierozpuszczalnymi substancjami)

  • Obecność składników różnicujących oraz wybiórczych w podłożach specjalnych

  • Jałowość (metody wyjaławiania omówione w przewodniku do ćwiczenia 1)

  • Odpowiednie pH:

    • Zazwyczaj 7,2-7,4 i odpowiedni potencjał oksydoredukcyjny

Podział podłoży

  • Z uwagi na skład chemiczny:

    • Naturalne:
    • nie do końca zdefiniowany skład chemiczny
    • wyciągi z tkanek roślinnych/zwierzęcych (np. bulion, mleko)
    • Syntetyczne:
    • dokładnie określony skład chemiczny (np. podłoże Davisa)
    • Półsyntetyczne:
    • mieszanka obu powyższych

  • Z uwagi na zawartość składników odżywczych:

    • Minimalne:
    • tylko niezbędne składniki pokarmowe
    • Pełne:
    • wszystkie niezbędne substancje do wzrostu
    • np. bulion odżywczy
    • Wzbogacone:
    • z dodatkiem krwi, surowicy, innych składników

  • Z uwagi na konsystencję:

    • Płynne:
    • do namnażania oraz oznaczania obecności drobnoustrojów
    • Półpłynne:
    • 0,1-0,7% agaru, do badania ruchu bakterii
    • Stałe:
    • 1,5-2% agaru, do izolacji i różnicowania drobnoustrojów

  • Agar (czynnik zestalający):

    • wielocukier z galaktozą
    • uzyskiwany z krasnorostów
    • ulega hydrolizie w środowisku kwaśnym i traci zdolność do tworzenia żelu

  • Z uwagi na przeznaczenie:

    • Namnażające:
    • do uzyskania hodowli o wysokiej populacji drobnoustrojów
    • przykład: bulion, brzeczka
    • Wybiórcze:
    • z substancjami hamującymi mikroflorę towarzyszącą (substancje wybiórcze)
    • przykład: pożywka z żółcią dla pałeczek grupy coli
    • Różnicujące:
    • diagnostyczne, pozwalające na rozróżnienie bakterii
    • Wybiórczo-różnicujące:
    • łączą oba wcześniejsze typy podłoży, przykład: VRBL-agar, MacConkey
    • Transportowe:
    • utrzymanie mikroflory i przeżywalności drobnoustrojów w trakcie transportu

Składniki wybiórcze (selektywne)

  • Przykłady hamujących rozwój mikroorganizmów:

    • Stosowane dla Gram-ujemnych:
    • azydek sodu, sole żółci
    • Stosowane dla Gram-dodatnich:
    • fiolet krystaliczny, zieleń brylantowa
    • Stosowane do hodowli grzybów:
    • chloramfenikol, oxytetracyklina

  • Wybiórczość podłoża można zwiększyć przez:

    • wyższą koncentrację NaCl
    • zakwaszenie podłoża do pH 3,5

Wskazówki dotyczące przygotowania podłoży

  • Używać dobrze umytego szkła, często wyjałowionego
  • Przestrzegać ściśle przepisu przygotowywania pożywek
  • Używać wyłącznie wody destylowanej
  • Ustalić odpowiednie pH
  • Wyjaławiać w autoklawie w odpowiednich objętościach (nie więcej niż ¾ objętości kolby)
  • Kolby i probówki zakorkować korkami z waty, ligniny, aluminium

Formy gotowych podłoży

  • Płynna: probówki lub kolby
  • Upłynniona: np. słupki agaru odżywczego
  • Zestalona: w probówkach
  • Zestalona w płytkach Petriego: dla posiewów metodami

Metody posiewów

  • Metody posiewu w analizie mikrobiologicznej:
    • Do pożywek płynnych w probówkach:
    • za pomocą ezy
    • przy użyciu pipety (badania ilościowe)
    • Do podłoży zestalonych w probówkach:
    • metodą kłutą
    • na skosy metodą powierzchniową
    • Do upłynnionych podłoży agarowych w probówkach:
    • Do płytek Petriego:
    • metoda wgłębna
    • powierzchniowa
    • izolacyjna

Metody hodowli - dostęp tlenu

  • Zależnie od oddychania mikroorganizmów:
    • Tlenowe: dla tlenowców i względnych beztlenowców
    • Beztlenowe: dla ścisłych beztlenowców
    • Zmodyfikowana atmosfera: 5-10% tlenu, zwiększona zawartość CO2 dla mikroaerofili

Sposoby zapewnienia beztlenowych warunków hodowli

  • Hodowla w wysokim słupie
  • Zalanie posiewów drugą warstwą podłoża agarowego
  • Hodowla w anaerostatach
  • Hodowla w cieplarkach ze zmodyfikowaną atmosferą
  • Użycie korka pyrogallolowego

Temperatura inkubacji

  • Hodowle drobnoustrojów prowadzi się w temperaturach optymalnych:
    • 24-72 godzin dla bakterii
    • 96 godzin dla grzybów

Część praktyczna – ćwiczenie 4

  1. Posiewy dla izolacji:
    • Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Saccharomyces cerevisiae
    • Materiał to 3 kultury A, B, C
    • Przykłady posiewów:
    • Kultura A: bulion z glukozą, agar odżywczy
    • Kultura B: pożywka z żółcią, agar odżywczy, podłoże VRBL-agar
    • Kultura C: pożywka wg Burzyńskiej, agar odżywczy
  2. Badanie stosunku do tlenu:
    • Szczepy: Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Clostridium butyricum
    • Posiew metodą kłutą
  3. Badanie właściwości gazotwórczych:
    • Zusammensetzung: Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Clostridium butyricum
    • Posiew 1 cm³ do upłynnionego słupka bulion agar z glukozą

Część praktyczna – ćwiczenie 5

  1. Odczyt wyników posiewów, zestawienie w tabelach i interpretacja
    • Tabela 1: Kultura w różnorodnych podłożach
    • Tabela 2: Szczepy – właściwości gazotwórcze, stosunek do tlenu

Rysunki:

  • Rysunek 1: Komórka w różnych środowiskach
  • Rysunek 2: Efekt posiewu na podłoże wybiórczo-różnicujące
  • Rysunek 3: Posiew metodą kłutą
  • Rysunek 4: Hodowle na słupkach agarowych bez glukozy
  • Rysunek 5: Posiew na powierzchnię skosu
  • Rysunek 6: Badanie właściwości gazotwórczych
  • Rysunek 7: Posiew metodą izolacyjną
  • Rysunek 8: Sposoby zapewniania beztlenowych warunków hodowli