Biologie Celulara si Moleculara - Sinteza Proteinelor

Sinteza Proteinelor

• Proteinele sunt molecule complexe cu rol structural, în mișcare, activitate enzimatică și interacțiunea cu exteriorul celulei.
• Celulele sunt compuse din mii de proteine cu structuri și funcții diferite, dependente de secvențele de aminoacizi și structurile tridimensionale.
• Proteinele sunt polimeri de aminoacizi într-o secvență liniară, sintetizate de ribozomi.
• Ribozomii sunt organite ribonucleoproteice care sintetizează proteine prin legături peptidice între aminoacizii transportați de ARNt, într-o secvență specifică ARNm. Acest proces se numește traducere.
• Informația genetică este codificată de ADN, care codifică proteine și ARN.
• Informația ADN este transcrisă în ARN, urmată de traducere, unde ARNm este citit în ribozomi cu ajutorul ARNt pentru a forma un polipeptid.
• Sinteza proteinelor (traducerea) are loc în citosol, finalizându-se în lumenul reticulului endoplasmatic pentru proteinele destinate secreției celulare.
• Celulele eucariote sintetizează diferite tipuri de ARN, inclusiv ARNm (codant), ARNr și ARNt (efectori), și microARN, ARNsi, ARNsn (reglatori).
• ARN-urile mature sunt generate prin prelucrare post-transcriere.

Tipuri de ARN

• ARNm: codifică proteine.
• ARNr: formează structura de bază a ribozomilor și catalizează sinteza proteinelor (75% din totalul ARN-urilor).
• ARNt: funcționează ca adaptor între ARNm și aminoacizii corespondenți codonilor.
• microARN: reglează expresia genelor prin blocarea traducerii ARNm-ului specific și degradarea acestuia.
• ARNsn: rol în procese nucleare, inclusiv în scindarea pre-ARNm.
• ARNsno: rol în procesarea/modificarea ARNr.
• ARNsi: determină compactarea cromatinei și degradarea selectivă a ARNm (scad expresia genică).
• ARNlnc: reglează procese celulare, inclusiv inactivarea cromozomului X.

Ribozomii

• Complexe macromoleculare compuse din ARNr și proteine ribozomale.
• Particule electronodense cu diametrul de 15–20 nm, formate din subunități mici și mari care interacționează în traducere.
• Ribozomii eucariotelor și procariotelor sunt similari structural și funcțional.
• Tipuri de ribozomi:
  • 70S: în celulele procariote (2,7 MDa) cu subunități 50S și 30S.
  • 80S: în citosolul celulelor eucariote (4,3 MDa) cu subunități 60S și 40S.
  • 55S: în mitocondrii (~3 MDa) cu subunități 39S și 28S.
• ARN ribozomal:
  • Procariote: 3 molecule (23S, 5S în subunitatea mare și 16S în subunitatea mică).
  • Mitocondrii: 3 molecule (16S, CPtRNA în subunitatea mare și 12S în subunitatea mică).
  • Eucariote: 4 molecule (28S, 5.8S, 5S în subunitatea mare și 18S în subunitatea mică).
• Proteinele ribozomale sunt bazice, mici (10-30 kDa) și legate de suprafața ribozomilor:
  • Procariote: aproximativ 54 proteine.
  • Eucariote: aproximativ 80 proteine (citosol).
  • Mitocondrii: aproximativ 82 proteine.
• Diferențele structurale între ribozomii procariotelor și eucariotelor sunt exploatate de antibiotice care inhibă sinteza proteică bacteriană.
• Antibioticele inhibă expresia genică bacteriană prin legarea de ribozomii bacterieni, fără a afecta celulele eucariote.
• Antibiotice comune: aminoglicozide (streptomicina), macrolide (eritromicină), lincosamide (clindamicină), tetracicline și cloramfenicol.
• Fungii și bacteriile ocupă nișe ecologice similare, fungii creând toxine care ucid bacteriile dar sunt inofensive pentru ei înșiși.
• Bacteriile dezvoltă rezistență la antibiotice, fiind necesară generarea de noi terapii.

Subunități Ribozomale

• Subunitatea mică: asigură legarea ARNt și decodarea ARNm.
• Subunitatea mare: asigură funcția enzimatică a ribozomilor (ribozimă peptidil transferază), realizând legătura peptidică între aminoacizii aduși de ARNt.
• Subunitățile ribozomale libere interacționează în citosol pentru a traduce o moleculă de ARNm.
• Decodarea ARNm și sinteza polipeptidului au loc într-o cavitate între subunitățile ribozomale, unde interacționează ARNr cu ARNm și ARNt.

Spații Specifice în Cavitatea Ribozomală:

• A (situs acceptor): interacțiunea codon-anticodon între ARNm-ARNt.
• P (situs peptidil): locul ARNt purtător al lanțului polipeptidic.
• E (situs de ieșire): eliberarea ARNt deacilat.
• Tunel de ieșire: în subunitatea mare, pentru lanțul polipeptidic sintetizat.
• Ribozomii din citosolul eucariot sunt 80S (60S + 40S), liberi sau atașați la RER sau anvelopei nucleare.
• Numărul ribozomilor variază în funcție de intensitatea sintezei proteice.
• Poliribozomii/polizomii: structuri spiralate cu mai mulți ribozomi atașați de o moleculă de ARNm, producând simultan mai multe copii ale unei proteine.
• Bazofilia citoplasmatică indică o sinteză proteică intensă (număr crescut de ribozomi).

Biogeneza Ribozomilor

• Subunitățile ribozomale sunt sintetizate în nucleol și transferate separat în citosol.
• Genele ARNr sunt situate pe cromozomii 13, 14, 15, 21, 22.
• Nucleolul este specializat în biogeneza ribozomilor, având următoarele zone:
  • Zona fibrilară: centrul de organizare nucleolară (NOR), conține genele pentru ARNr.
  • Zona densă fibrilară (ZDF): transcriere activă a ADN în ARNr.
  • Zona granulară (ZG): ARNr precursor complexat cu proteine (subunități în formare).
• ARN polimeraze:
  • ARN-polimeraza I: transcrie pre-ARNr 45S (precursor pentru ARNr 28S, 5.8S și 18S) în nucleol.
  • ARN-polimeraza III: transcrie ARNr 5S în nucleu (în afara nucleolului), ulterior translocat în nucleol.
• Procesarea pre-ARNr 45S și complexarea cu proteine ribozomale importate din citosol au loc în nucleol.
• Formarea subunităților ribozomale implică interacțiunea a aproximativ 200 de proteine și peste 100 de ARNsno.
• Subunitățile ribozomale (60S și 40S) sunt transferate separat în citosol prin porii nucleari, unde are loc maturarea finală.
• Asamblarea ribozomilor are loc în citosol în timpul traducerii prin legarea de ARNm.
• Moleculele de ARNr sunt mari (121-5000 nucleotide) și se pliază formând anse și segmente dublu catenare.
• Proteinele ribozomale asigură stabilitatea structurilor tridimensionale ale ARNr.

ARN Mesager (ARNm)

• Format în nucleu prin transcriere, unde codul genetic pentru o proteină este transcris din ADN într-o moleculă pre-ARNm sub acțiunea ARN-polimerazei II.
• După modificările post-transcriere (splicing, excizia intronilor, adăugarea cozii poli(A) și a capișonului de metilguanozină), ARNm părăsește nucleul și migrează în citoplasmă.
• ARNm matur este o moleculă monocatenară cu lungime variabilă ce conține codul pentru o singură proteină în celulele eucariote (ARNm monocistronic).
• În celulele procariote, o moleculă de ARNm codifică de obicei mai multe proteine (ARNm policistronic).
• Transportul ARNm din nucleu în citosol este selectiv, mediat de complexele porilor nucleari.
• Proteinele care leagă coada 3’ poli-A și capacul 5’ ARN indică faptul că o moleculă de ARNm este „bună de export”.

Segmente Structurale ale ARNm:

• Capătul 5`: tri-fosfo-7-metil-guanozină – permite legarea factorilor de inițiere.
• Regiunea netradusă 5`UTR: conține o regiune de legare a subunității mici a ribozomilor.
• Codon START: AUG într-o secvență Kozak consensus sequence (ACCAUGG).
• Segment codant: codifică un lanț polipeptidic specific unei proteine.
• Codon STOP: UGA, UAG, UAA.
• Regiune netradusă 3` UTR: rol reglator post-traducere.
• Capătul 3` poliadenilat: asigură exportul din nucleu și stabilitatea ARNm în citosol.
• Moleculele ARNm mature sunt traduse și degradate în citosol.
• ARNm este codant, informația fiind codată în codoni (secvențe de 3 nucleotide).
• Există 64 de codoni, 61 codifică aminoacizi, iar 3 semnalizează încheierea sintezei proteice (STOP).
• Codonul AUG (metionina) este situat în prima poziție a secvenței codante.
• Metionina poate fi îndepărtată în procesul de maturare al proteinei.
• Fiecărui codon îi corespunde un aminoacid, iar secvența codonilor determină secvența aminoacizilor.
• Durata de viață a ARNm influențează cantitatea de proteină produsă.
• ARNm sunt degradate de ribonucleaze (ARN-aze) în citosol; durata de viață variază.
• În procariote, ARNm sunt degradate rapid (durata de viață de aproximativ 3 minute).
• În eucariote, durata de viață variază (30 minute - >10 ore).
• Proteinele realizate în cantități mari sunt codificate de ARNm cu durată de viață lungă.

ARN de Transfer (ARNt)

• Molecule adaptor care preiau aminoacizii din citosol și îi poziționează în ribozomi, conform secvenței ARNm.
• Codonii ARNm nu recunosc direct aminoacizii; traducerea depinde de moleculele adaptor (ARNt).
• ARNt au o lungime de aproximativ 80 de nucleotide.
• ARNt sunt transcrise ca precursori pre-ARNt în nucleu sub acțiunea ARN-polimerazei III.
• ARNt conțin nucleotide atipice (Ψ, D, I) modificate post-transcriere (epigenetic).
• Molecula ARNt se pliază într-o structură tridimensională prin formarea de legături între baze complementare.
• Patru segmente scurte din ARNt pliat sunt dublu spiralate, generând o structură similară unei frunze de trifoi (structura secundară).
• Frunza de trifoi se pliază într-o structură tridimensională compactă (structura terțiară).
• ARNt este o moleculă dublu-catenară de aproximativ 80 nucleotide (3,8S), în formă de trifoi cu patru foi.

Situsuri Funcționale ARNt:

• Pol acceptor (3’-CCA-OH): leagă aminoacidul corespunzător anticodonului.
• Pol anticodon: secvență de 3 baze azotate complementară unui codon ARNm.
• Braț T: asigură interacțiunea cu ribozomul (situsurile A, P, E).
• Braț D: asigură interacțiunea cu ARNt-sintetaza corespunzătoare.
• Anticodonul și regiunea monocatenară de la capătul 3’ (unde aminoacidul este atașat covalent) sunt esențiale pentru funcția ARNt.
• Codul genetic este degenerat: numeroși aminoacizi sunt codificați de mai mulți codoni (sinonimi).
• Există 48 de molecule distincte de ARNt care recunosc specific 20 de aminoacizi și 61 de codoni.
• Un ARNt poate lega aminoacizi diferiți (abundența acestora în proteine).
• Un aminoacid poate fi purtat de ARNt diferite.
• Un ARNt poate recunoaște codoni diferiți datorită interacțiunii atipice (wobble base pairing).
• Mai mulți codoni pot specifica un singur aminoacid (codul genetic este redundant).
• Unii aminoacizi au mai mult de un ARNt, iar unele molecule de ARNt tolerează o nepotrivire (wobble) la a treia poziție a codonului.
• Împerecherile de baze de tip „wobble” fac posibilă potrivirea celor 20 de aminoacizi cu cei 61 de codoni folosind mai puțin de 31 de molecule ARNt diferite.

Aminoacil-ARNt-Sintetaze

• Enzime care cuplează specific un aminoacid cu ARNt corespunzător.
• Există 20 de aminoacil-ARNt-sintetaze (câte una pentru fiecare aminoacid).
• Reacția de acilare a ARNt are loc în doi pași:
  • $aminoacid + ATP \rightarrow aminoacil-AMP + PPi$
  • $aminoacil-AMP + ARNt \rightarrow aminoacil-ARNt + AMP$
• Clase de aminoacil-ARNt-sintetaze:
  • Clasa I: atașează restul aa- de –OH din 2’ al adenozinei.
  • Clasa II: atașează restul aa- de –OH din 3’ al adenozinei.
• Aminoacil-ARNt-sintetazele au un proces precis de recunoaștere necesar pentru a menține fidelitatea informațiilor genetice.
• Erorile în acest proces sunt sub 1 la 100.000 de evenimente.
• Regiunea anticodon a ARNt, secvențe nucleotidice ale brațului D și secvențe al brațului acceptor sunt recunoscute specific de aminoacil-ARNt-sintetaza corectă.
• Reacția de atașare a aminoacidului la capătul 3’ al ARNt catalizată de sintetază necesită energie (hidroliza ATP).
• Energia acestei legături este folosită pentru legarea covalentă a aminoacidul în lanțul polipeptidic în formare.

Sinteza Proteinelor

• Are loc în citosol și este realizată de ribozomi.
• Decodarea ARNm și sinteza polipeptidului au loc într-o cavitate între cele 2 subunități (interacționează ARNr, ARNm și ARNt).
• Subunitatea mică asigură legarea ARNm și decodarea acestuia de ARNt.
• Subunitatea mare asigură funcția enzimatică (ribozimă) și catalizează legăturile peptidice.
• Ribozomii eucarioti adaugă aproximativ 2 aminoacizi pe secundă, iar cei bacterieni adaugă aproximativ 20 aminoacizi pe secundă.

Etapele Sintezei Lanțului Polipeptidic:

1. Inițierea sintezei (factori de inițiere – IF).
2. Elongarea lanțului (factori de elongare - EF).
3. Terminarea sintezei (factori de eliberare – RF).

• Factorii de inițiere, de elongare și de terminare sunt proteine g mici din superfamilia Ras GTP-azelor.
• Cele două subunități ribozomale se reunesc pe ARNm aproape de capătul 5ʹ.
• ARNm este deplasat în direcția 5ʹ–3ʹ, ribozomul traducând secvența de nucleotide într-o secvență de aminoacizi.
• Ribozomul conține trei situsuri de legare pentru molecule de ARNt (situs A, situs P și situs E).
• Traducerea ARNm începe cu codonul start AUG, necesitând un ARNt încărcat special cu metionină.
• Toate proteinele recent sintetizate au metionină ca prim aminoacid, care poate fi ulterior îndepărtată.
• În eucariote, ARNt inițiator și factori de inițiere formează complexul de inițiere în situsul P al subunității mici ribozomale.
• Subunitatea ribozomală mică scanează ARNm până când întâlnește primul AUG.
• Factorii de inițiere se disociază pentru a permite subunității ribozomale mari să se lege.
• Sinteza proteinelor începe cu adăugarea următorului ARNt încărcat în situsul A.
• Un nou ARNt încărcat intră în situsul A și se leagă de codonul complementar.
• Aminoacidul este adăugat în lanțul peptidic în creștere ținut de ARNt din situsul P.
• Subunitatea ribozomală mare înaintează, mutând ARNt descărcat în situsul E.
• Acest ciclu se repetă până când apare un codon stop în ARNm.
• Factorii de eliberare se leagă de codonul stop și alterează activitatea peptidil transferazei.
• Capătul carboxil al lanțului polipeptidic este eliberat, iar ribozomul eliberează ARNm și subunitățile disociază.

Controlul Interacțiunii ARNr, ARNm, ARNt

• Complementaritatea interacțiunii bazelor: codon – anticodon.
• Plierea ribozomului pe bazele cu complementaritate corectă permite continuarea procesului.
• Hidroliza GTP din factorii de inițiere/elongare/terminare și disocierea acestora.
• Sinteza proteinelor este realizată cu eficiență crescută de poliribozomi.
• ARNm care sunt traduse eficient se găsesc sub formă de poliribozomi.
• Poliribozomii sunt alcătuiți din mai mulți ribozomi distanțați la aproximativ 80 de nucleotide de-a lungul ARNm.

Localizarea Celulară a Proteinelor

• Ribozomii liberi sintetizează proteine care rămân în citoplasmă.
• Proteinele destinate nucleului, mitocondriilor sau peroxizomilor sunt sintetizate tot de către ribozomii liberi și apoi direcționate către compartimentul țintă.
• Ribozomii atașați RER sintetizează proteine care rămân în membranele sau lumenul RER și proteine livrate aparatului Golgi.
• Secvențe semnal direcționează transportul co-traducere sau post-traducere al polipeptidelor/proteinelor către destinația structurală și funcțională.
• În absența unei secvențe semnal, proteinele sintetizate de ribozomii liberi rămân în citosol.

Secvențe Semnal:

• Import în reticul endoplasmic:
  • +H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-Leu-Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu- Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-Val-Phe-Gln-
  • -Lys-Asp-Glu-Leu-COO–
• Import în nucleu: -Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-
• Export din nucleu:
  • -Met-Glu-Glu-Leu-Ser-Gln-Ala-Leu-Ala-Ser-Ser-Phe-
• Import în mitocondrie:
  • +H3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu- Cys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu-
• Import în peroxizomi: -Ser-Lys-Leu-COO–
• Proteinele sunt importate post-traducere în toate organitele, cu excepția celor preluate de RER (co-traducere).
• Peptide semnal sunt găsite în secvența primei grupe de 15-60 de aminoacizi de la capătul amino-terminal al unei proteine nou sintetizate.
• Transportul proteinelor în RER necesită o secvență semnal (5-10 aminoacizi hidrofobi).
• SRP (particula de recunoaștere a semnalului) se leagă de ribozom și de secvența semnal, oprind alungirea lanțului polipeptidic.
• Complexul SRP–ribozom este relocat către membrana RER.
• Legarea SRP la o proteină de acostare aliniază ribozomul cu un complex proteic transmembranar al RER numit translocon.
• Transloconul introduce lanțul polipeptidic în lumenul cisternei RER.
• Secvența semnal este îndepărtată de o peptidază specifică.
• La finalizarea sintezei, ribozomul se detașează de translocon.

Mecanisme Celulare de Pliere a Proteinelor

• Proteinele nou sintetizate trebuie să se plieze în forma tridimensională corectă.
• Unele proteine se pliază spontan, pe măsură ce ies din ribozom.
• Anumite secvențe de aminoacizi pot determina plierea spontană.
• Plierea spontană de tip I începe din tunelul de ieșire din ribozom (diametru de 20Å și o lungime de 100Å).
• Cele mai multe proteine necesită asistență din partea proteinelor șaperon, care le direcționează în procese de pliere eficiente și împiedică agregarea lor în interiorul celulei.
• Șaperonele asigură plierea corectă a altor proteine și previn agregarea proteinelor nepliate complet.
• Co-șaperonele asistă alte șaperone în plierea proteinelor.
• Șaperonele sunt localizate în toate compartimentele celulare.

Clasificarea Șaperonelor:

• Holdaze: ATP independente, leagă situsurile hidrofobe și previne agregarea (DnaJ, Hsp33).
• Foldaze: ATP dependente, asigură plierea activă (Hsp60, Hsp70).
• Multe șaperone fac parte din clasa proteinelor de șoc termic (HSP).
• Proteinele necesită ajustări suplimentare (modificări covalente, legarea de cofactori).
• Modificările post-traducere sunt necesare pentru ca o proteină nou sintetizată să devină complet funcțională.
• Concentrația finală a unei proteine depinde de rata de realizare a fiecărei etape din procesul parcurs de la ADN la proteina matură, funcțională.
• Inițierea transcrierii este punctul principal de control al expresiei unei gene.

Mecanisme Celulare de Degradare a Proteinelor

• Celulele controlează activitatea și longevitatea proteinelor.
• Viața proteinelor variază (luni/ani - secunde).
• Proteazele degradează proteinele în peptide scurte și aminoacizi individuali.
• Proteazele recunosc și elimină proteinele deteriorate sau pliate greșit.
• Aminoacizii rezultați din proteoliză sunt refolosiți pentru a face noi proteine.
• În celulele eucariote, proteinele sunt degradate de proteazomi.
• Proteazomii au forma unui butoiaș și conțin proteaze orientate spre interior.
• Capacele leagă proteinele destinate degradării și le introduc în camera interioară.
• Proteazele taie proteinele în peptide scurte, care sunt evacuate.
• Proteinele sunt marcate pentru distrugere prin atașarea covalentă a ubiquitinei.

Ubiquitină:

• Proteină globulară mică (8,5 kDa).
• Ubiquitina formează lanțuri ca rezultat al legăturii covalente între lizine.
• Enzime specializate marchează proteinele cu un lanț scurt de molecule de ubiquitină.
• Proteinele ubiquitinilate sunt recunoscute, depliate și introduse în proteazomi.
• Proteinele citosolice și proteinele retro-translocate din lumenul RER poliubiquitinate sunt degradate la nivelul proteazomilor citosolici.
• O secvență scurtă marchează proteinele ce trebuie ubiquitinilată și degradată.
• Proteinele deteriorate sau greșit pliate sunt, de asemenea, recunoscute și degradate.
• Enzimele care adaugă un lanț de poliubiquitină recunosc semnalele care sunt expuse ca urmare a plierii sau deteriorări.
• PROTEOMUL este totalitatea proteinelor exprimate într-o celulă, țesut sau organism la un anumit moment.
• Menținerea unui echilibru constant între sinteza și degradarea proteinelor asigură buna funcționare a celulei.

Concepte Esențiale

• Fluxul informației genetice: ADN → ARN → proteină (dogma centrală a biologiei celulare).
• Conversia instrucțiunilor genetice: expresie genică.
• Transcrierea este catalizată de ARN polimerază.
• ARN diferă de ADN (riboză în loc de dezoxiriboză, uracil în loc de timină).
• Celulele realizează ARNm, ARNr și ARNt.
• Genele eucariote conțin exoni și introni.
• Intronii sunt îndepărtați prin splicing.
• Pre-ARNm trec prin procesare suplimentară (căpăcirea capătului 5ʹ și poliadenilare 3ʹ).
• Traducerea are loc în ribozomi, în citoplasmă.
• ARNm este citit în codoni (seturi de trei nucleotide).
• Corespondența dintre aminoacizi și codoni este specificată de codul genetic (64 de codoni).
• ARNt acționează ca molecule adaptoare (48 molecule de ARNt în eucariote).
• Aminoacil-ARNt-sintetaze leagă aminoacizii la ARNt (20 de sintetaze).
• ARNt conține un anticodon.
• Sinteza proteinei începe cu codonul de inițiere (AUG).
• Legarea treptată a aminoacizilor este catalizată de o ribozimă (ARNr).
• Concentrația proteinei depinde de rata de sinteză și degradare a ARNm și proteinei.
• Degradarea proteinelor poliubiquitinilate are loc în proteazomi.
• Biosinteza proteinelor este inițiată în citosol și continuată în RER (pentru unele proteine).
• Biosinteza necesită cooperarea ARNr, ARNm, ARNt, (IF, EF, RF).
• Proteinele nou sintetizate necesită pliere corectă (spontană sau asistată).
• Proteinele incorect pliate sunt degradate de proteazomi după poliubicuitinare.
• Proteinele corect pliate sunt direcționate către compartimente specifice conform unor „secvențe semnal”.