Detailed Notes on Protein Analysis and Western Blotting

Análisis de Proteínas: Electroforesis, Transferencia e Inmunodetección

Western Blot: Visión General

• Definición: Técnica analítica para el estudio de proteínas, que permite detectar una sola proteína en una muestra biológica.

• Especificidad: Se logra mediante un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de interés.

• Aplicaciones:

  • Estimar el tamaño de una proteína.

  • Confirmar modificaciones post-traduccionales (ej. fosforilación).

  • Comparar cuantitativamente los niveles de proteína entre muestras.

Preparación de las Muestras

• Objetivo: Extraer las proteínas de las muestras biológicas.

• Métodos: Disrupción mecánica o química.

• Materiales de partida: Tejidos de plantas y animales, células cultivadas, levaduras o bacterias.

• Disrupción mecánica:

  • Homogenizador: Disgrega los tejidos.

  • Fraccionamiento subcelular: Procesos adicionales para aislar orgánulos.

• Lisis celular:

  • Tampones con detergentes: Rompen las membranas celulares para liberar las proteínas.

Métodos Físicos para la Disrupción de Muestras

Soluciones Tampón y Detergentes Según Tipo/Localización de la Proteína

• Detergentes:

  • Rompen membranas celulares y solubilizan proteínas.

  • Clasificación: Iónicos (carga +/-), No iónicos (sin carga), Zwiteriónicos (carga neta 0).

Inhibidores de Proteasas y Fosfatasas

• Proteasas: Enzimas que degradan proteínas liberadas durante la rotura celular. Se deben evitar.

• Estrategias para evitar la degradación:

  • Evitar ciclos de congelación/descongelación.

  • Trabajar rápido y en frío.

  • Añadir inhibidores de proteasas al tampón de lisis.

• Fosfatasas: Reducir su actividad, especialmente en estudios de fosforilación. Se usan inhibidores de fosfatasas.

Tabla de Inhibidores de Proteasas y Fosfatasas

Electroforesis en Acrilamida (PAGE)

• Objetivo: Separar las proteínas del extracto según su tamaño. Se usa SDS-PAGE.

• SDS (Dodecil Sulfato Sódico):

  • Detergente aniónico.

  • Reviste las proteínas con carga negativa para que se separen por tamaño.

Medición de Proteína Total

• Importancia:

  1. Asegurar la carga correcta de proteínas.

  2. Realizar Western Blots cuantitativos o semi-cuantitativos.

• Métodos comunes: Lowry, Bradford y Ácido Bincocinínico (BCA).

• Curva estándar:

  • Se realiza con concentraciones crecientes de proteína pura (ej. BSA).

  • Se grafica la absorbancia en función de la concentración conocida.

  • Se extrapola la absorbancia de la muestra para determinar su concentración.

Elección de un Ensayo de Proteínas

• Factores a considerar:

  • Equipo disponible (espectrofotómetro, lector de placas).

  • Reactivos del tampón de lisis (sustancias interferentes).

  • Cantidad de muestra disponible.

  • Facilidad/rapidez del ensayo.

Métodos de Determinación de Proteínas

Tampón de Carga de Muestras

• Componentes: Glicerol, Azul de Bromofenol, SDS, Beta Mercaptoetanol o DTT, Tampón Tris.

• Preparación: Mezclar con las muestras de proteína y calentar a 95ºC durante 5-10 minutos (para condiciones desnaturalizantes/reductoras).

Gel de Electroforesis

• PAGE Nativo:

  • Sin SDS.

  • Las proteínas mantienen su estructura tridimensional.

  • La migración depende de la relación carga/tamaño.

• SDS-PAGE:

  • Con SDS (condiciones desnaturalizantes).

  • Las proteínas migran al electrodo positivo según su peso molecular.

Componentes del Gel de Acrilamida

Elección del Grosor del Gel y del Tamaño de Poro

• El tipo de muestra y el peso molecular de la proteína de interés dictan el espesor y tamaño de poro del gel.

• Los espaciadores de gel controlan el espesor del gel.

• Los geles con mayor espesor, pueden aceptar mayor volumen de carga.

• El porcentaje del gel, según la cantidad de acrilamida y bisacrilamida, determina el tamaño de poro.

• El tamaño de poro determina la ratio de separación de las proteínas.

Rango de Separación de Proteínas Según el Porcentaje de Acrilamida

Elaboración del Gel

*Preparación del molde con cristales, espaciadores, peines y sistema de sujeción.
*Verter la mezcla de reactivos en el molde.
*La acrilamida se polimeriza en aproximadamente 30 minutos.
*Para mejorar la nitidez de la banda, se utiliza un stacking gel (acrilamida de menor porcentaje).

Diseño Experimental: Controles y Estándares

• Marcadores de Peso Molecular:

  • Mezcla de proteínas purificadas de peso molecular conocido.

  • Verifican si la proteína de interés está en el rango de tamaño apropiado.

  • Preteñidos o incoloros.

• Controles Positivos:

  • Verifican si el anticuerpo primario se une a la proteína correcta.

  • Proteína purificada, línea celular que sobreexpresa la proteína, tejido que expresa altos niveles de la proteína.

*Controles de Carga:
*Proteínas con niveles de expresión constante (