Cykl Krebsa i Fosforylacja Oksydacyjna - Notatki

Cykl Kwasów Trikarboksylowych i Fosforylacja Oksydacyjna

Cykl Kwasów Trikarboksylowych (CKT)

• CKT (Cykl Krebsa): Tlenowe utlenianie glukozy (pirogronian → acetylo-CoA) do $CO_2$.
• Tlen nie bierze udziału bezpośrednio w cyklu, ale CKT może zajść tylko w warunkach tlenowych.
• $NAD^+$ i $FAD$ mogą być zregenerowane w mitochondrium tylko przez transport elektronów do tlenu. Glikoliza może zachodzić zarówno w warunkach tlenowych jak i beztlenowych.
• U organizmów eukariotycznych CKT zachodzi w mitochondrium, a glikoliza w cytozolu.
• CKT oraz fosforylacja oksydacyjna to źródło 95% energii użytecznej człowieka.
• W CKT regenerowany jest szczawiooctan, który może brać udział w utlenianiu wielu cząsteczek acetylowych.

Substraty i Produkty CKT

• Acetylo-CoA, substrat cyklu Krebsa, powstaje z rozpadu glikogenu, tłuszczów i wielu aminokwasów.
• W warunkach tlenowych pirogronian jest transportowany z cytozolu do mitochondrium przez przenośnik antyportowy (wymiana z $OH^-$.
• Dwa atomy węgla wchodzą do cyklu w postaci acetylo-CoA i opuszczają go w postaci dwóch cząsteczek $CO_2$.
• Trzy jony hydroniowe (6e^-$) zostają przeniesione na trzy cząsteczki NAD^+$.</li> <li>Jedna para atomów wodoru ($2e^-$) zostaje przeniesiona na jedną cząsteczkę $FAD$.
• Funkcją CKT jest odbieranie wysokoenergetycznych elektronów z substratów energetycznych.

Funkcje CKT

• CKT nie wytwarza dużej ilości ATP ani nie używa tlenu jako substratu w reakcjach.
• Usuwa elektrony z acetylo-CoA i wykorzystuje je do tworzenia NADH i FADH2.
• Podczas fosforylacji oksydacyjnej elektrony uwalniane podczas utleniania NADH lub FADH2 przepływają przez łańcuch transportu elektronów, tworząc gradient protonowy w poprzek błony.
• Protony przepływają przez syntazę ATP, umożliwiając syntezę ATP z ADP i nieorganicznego fosforanu.
• Tlen jest potrzebny pośrednio, jako końcowy akceptor elektronów z łańcucha transportu elektronów, niezbędny do regeneracji $NAD^+$ i $FAD$.

Kompleks Dehydrogenazy Pirogronianowej

• Reakcja: pirogronian + CoA + $NAD^+$ → acetylo-CoA + $CO_2$ + NADH
• Katalizowana przez kompleks dehydrogenazy pirogronianowej (kompleks enzymatyczny – produkty pośrednie przechodzą z jednego miejsca aktywnego w drugie).
• Pirogronian może powstawać z glikogenu, tłuszczów i wielu aminokwasów.
• Pirogronian z glikolizy jest transportowany z cytoplazmy do mitochondrium (warunki tlenowe).
• Elektrony przechwycone w postaci NADH.

Przebieg CKT

• Podczas kondensacji acetylo-CoA ze szczawiooctanem dołączane są dwa atomy C; podczas regeneracji szczawiooctanu odłączane są inne atomy C niż te, które weszły do cyklu.
• Szybkość tworzenia α-ketoglutaranu decyduje o szybkości działania całego cyklu.
• Kluczowe enzymy: syntaza cytrynianowa, akonitaza, dehydrogenaza izocytrynianowa.

Reakcje w Cyklu Krebsa

• Przemiany związków:
  • Szczawiooctan + Acetylo-CoA → cytrynian
  • Cytrynian → izocytrynian
  • Izocytrynian → α-ketoglutaran + $CO_2$
  • α-ketoglutaran → bursztynylo-CoA + $CO_2$
  • Bursztynylo-CoA → bursztynian + GTP
  • Bursztynian → fumaran
  • Fumaran → jabłczan
  • Jabłczan → szczawiooctan
• Enzymy biorące udział w cyklu Krebsa:
  • Syntaza cytrynianowa
  • Akonitaza
  • Dehydrogenaza izocytrynianowa
  • Kompleks dehydrogenazy α-ketoglutaranowej
  • Syntetaza bursztynylo-CoA
  • Dehydrogenaza bursztynianowa
  • Fumaraza
  • Dehydrogenaza jabłczanowa

Tabela Reakcji w Cyklu Krebsa

Produkty Utleniania w CKT

• Podczas czterech reakcji utleniania cykl opuszczają 3 cząsteczki NADH + $H^+$ i jedna cząsteczka $FADH_2$.
• NADH + $H^+$ i $FADH_2$ są utleniane w łańcuchu oddechowym:
  • -2,5 cząst. ATP / cząst. NADH + $H^+$
  • -1,5 cząst. ATP / cząst. $FADH_2$
• Tworzy się jedna cząsteczka o wysokim potencjale przenoszenia grupy fosforanowej (GTP).
• Zużywane są dwie cząsteczki $H_2O$.

Bilans Energetyczny Utleniania Glukozy

Kontrola CKT

• Głównymi punktami kontroli są enzymy allosteryczne: dehydrogenaza izocytrynianowa i dehydrogenaza α-ketoglutaranowa.
• U wielu bakterii regulowane jest również wprowadzenie do cyklu fragmentów dwuwęglowych.

Prekursory Biosyntez

• Intermediaty CKT w przypadku zużycia do biosyntez muszą być szybko uzupełniane, np. szczawiooctan powstaje z pirogronianu w reakcji katalizowanej przez karboksylazę pirogronianową (glukoneogeneza!).

Cykl Glioksalowy

• Umożliwia wielu roślinom i bakteriom wzrost na octanie. Nie występuje u innych organizmów.
• Izocytrynian zamiast dekarboksylacji ulega rozszczepieniu na bursztynian i glioksalan.
• Omija dwa etapy dekarboksylacji zachodzące w CKT.
• Na jeden obrót przypadają dwie cząsteczki acetylo-CoA.
• Reakcja: 2 acetylo-CoA + $NAD^+$ + 2$H_2O$ → bursztynian + 2CoA + NADH + $H^+$ + 2$H^+$.
• octan + CoA + ATP → acetylo-CoA + AMP + $PP_i$
• U roślin w glioksysomach.

Fosforylacja Oksydacyjna

• Proces syntezy ATP zachodzący w wyniku przeniesienia elektronów z NADH + $H^+$ lub $FADH<em>2$ na $O</em>2$ przez szereg przenośników elektronów (łańcuch transportu elektronów).
• Przepływ elektronów z NADH + $H^+$ lub $FADH<em>2$ na $O</em>2$ przez kompleksy białkowe znajdujące się w błonie wewnętrznej mitochondriów powoduje wypompowanie protonów z matriks na zewnątrz.
• Synteza ATP zachodzi na skutek przepływu protonów przez kompleks enzymatyczny z powrotem do matriks.
• Główne źródło ATP u organizmów tlenowych.
• 26 z 30 cząsteczek ATP powstaje podczas fosforylacji oksydacyjnej (z jednej cząsteczki glukozy rozkładanej podczas glikolizy).
• W komórkach eukariotycznych fosforylacja oksydacyjna zachodzi w mitochondriach.

Łańcuch Oddechowy

• W skład łańcucha oddechowego wchodzą cztery kompleksy: 3 pompy i kompleks fizycznie związany z CKT.
• Nazwy kompleksów:
  • I: Oksydoreduktaza NADH-Q
  • II: Reduktaza bursztynian-Q
  • III: Oksydoreduktaza Q – cytochrom c
  • IV: Oksydaza cytochromu C (cytochromowa)
• Transport elektronów z oksydoreduktazy NADH-Q do oksydoreduktazy Q - cytochrom C przez zredukowaną formę koenzymu Q (ubichinon), związek szybko dyfundujący w błonie mitochondrialnej.
• Ubichinon przenosi także elektrony z $FADH_2$ dostarczane przez reduktazę bursztynian Q.
• Cytochrom c, małe rozpuszczalne białko, przenosi elektrony z oksydoreduktazy Q – cytochrom c na oksydazę cytochromu c.

Składniki Łańcucha Transportu Elektronów

Oksydoreduktaza NADH-Q

• Katalizowana reakcja: NADH + Q + 5$H^+$ matriks → $NAD^+$ + $QH_2$ + 4$H^+$ cytozol.
• Redukcja Q do $QH_2$ powoduje pobranie dwóch protonów z matriks.
• Przejście dwóch elektronów z NADH do koenzymu Q za pośrednictwem oksydoreduktazy NADH-Q powoduje wypompowanie czterech jonów $H^+$ z matriks mitochondrialnej.
• Elektrony przenoszone są z kompleksu I do kompleksu III przez zredukowaną formę koenzymu Q (ubichinonu).
• Ubichinon przenosi także do kompleksu III elektrony z $FADH_2$ dostarczane przez kompleks II.

Ubichinon - Koenzym Q

• Redukcja ubichinonu (Q) do ubichinolu ($QH_2$) przebiega poprzez intermediat, anion semichinonowy (Q^-$).
• Reakcje utleniania i redukcji ubichinonu.

Reduktaza Bursztynian Q

• Dehydrogenaza bursztynianowa (enzym CKT), który tworzy FADH_2$, stanowi część reduktazy bursztynian-Q. Kompleks ten jest integralną częścią wewnętrznej błony mitochondrialnej.</li> <li>W przeciwieństwie do pozostałych kompleksów, nie pompuje protonów. W konsekwencji podczas utleniania$FADH_2$tworzy się mniej cząsteczek ATP niż podczas utleniania NADH.</li> </ul> <h4 id="oksydoreduktazaqcytochromc">Oksydoreduktaza Q – Cytochrom C</h4> <ul> <li>Grupą prostetyczną jest hem.</li> <li>Przeniesienie elektronów z$QH2$do utlenionego cytochromu c oraz równoczesne wypompowanie protonów z matriks mitochondrialnej:$QH2$+ 2 cyt$c{utl}$+ 2$H^+$matriks → Q + 2cyt$c{red}$+ 4$H^+$cytozol.</li> </ul> <h4 id="cyklq">Cykl Q</h4> <ul> <li>Mechanizm sprzęgający przeniesienie elektronów z Q do cytochromu c z transportem protonów przez błonę.</li> </ul> <h4 id="etapycykluq">Etapy Cyklu Q</h4> <ol> <li>Związanie ubichinolu$QH2$w miejscu$Q0$.</li> <li>Przejście jednego z elektronów do centrum Fe-S, a następnie cytochromu$c_1$i w końcu do cytochromu c, który ulega redukcji.</li> <li>Cząsteczka zredukowanego cytochromu c odłącza się od enzymu.</li> <li>Przejście drugiego elektronu do cytochromu bL, a następnie bH i utlenionego ubichinonu (Q) związanego z miejscem Qi.</li> <li>Cząsteczka Q ulega redukcji do anionu semichinonowego ($Q^-$).
• Gdy dołączony $QH<em>2$ zostaje utleniony do Q, protony są uwalniane po cytozolowej stronie błony, natomiast cząsteczka Q opuszcza miejsce $Q</em>0$.
• Związanie drugiej cząsteczki $QH<em>2$ z miejscem $Q</em>0$ (powtórzenie pkt. 2-3).
• Przejście drugiego elektronu do $Q^-$ związanego w miejscu Qi.
• Pobranie dwóch protonów z matriks i powstanie $QH_2$. Usunięcie protonów przyczynia się do tworzenia gradientu protonowego.

Bilans Cyklu Q

• Dwie cząsteczki $QH_2$ są utleniane do dwóch cząsteczek Q
• Jedna cząsteczka Q jest redukowana do $QH_2$
• Dwie cząsteczki cytochromu są c ulegają redukcji
• Cztery protony są uwalniane po stronie cytoplazmatycznej
• Dwa protony są pobrane z matriks mitochondrialnej

Oksydaza Cytochromowa

• Utlenianie cytochromu c, zredukowanego na skutek działania kompleksu III, sprzężone z redukcją $O<em>2$ do dwóch cząsteczek $H</em>2O$.
• Dwa hemy i trzy jony miedzi w dwóch centrach (A i B).
• Oksydaza cytochromowa rozwijała w toku ewolucji zdolność do pompowania czterech dodatkowych protonów tak aby całkowita ilość protonów usuniętych z matrix wynosiła 8.

Regulacja Fosforylacji Oksydacyjnej

• Inhibitory transportu elektronów: rotenon, amytal, antymycyna A, CN, $N_3$, CO.
  • Miejsca blokad w łańcuchu oddechowym.

Hipoteza Chemiosmotyczna

• Transport elektronów i synteza ATP są sprzężone dzięki gradientowi protonowemu utworzonemu w poprzek błony mitochondrialnej.
• Przepływ elektronów przez łańcuch oddechowy powoduje przepompowanie protonów ze strony matriksowej na cytoplazmatyczną stronę wewnętrznej błony mitochondrialnej.
• Stężenie $H^+$ w matriks maleje i powstaje pole elektryczne, przy czym matriksowa strona błony ma ładunek ujemny.
• Siła protonomotoryczna napędza syntezę ATP katalizowaną przez syntazę ATP.

Syntaza ATP

• Duży kompleks enzymatyczny zanurzony w błonie.
• Główka (podjednostka F1) znajduje się w matriks mitochondrialnej i charakteryzuje się aktywnością katalityczną syntazy. Składa się z 5 rodzajów łańcuchów polipeptydowych: α3, β3, γ, δ, ε. Podjednostki α i β ułożone są naprzemiennie tworząc sześcioczłonowy pierścień. Podjednostki γ i ε tworzą trzonek, łańcuch γ posiada wydłużony fragment sięgający w głąb pierścienia αβ.
• F0 – podjednostka zakotwiczona w wewnętrznej błonie mitochondrialnej (kanał protonowy kompleksu). Jest to pierścień 10-14 zanurzonych w błonie podjednostek c. Od strony zewnętrznej pierścienia przylega jednostka a. Podjednostka b, podjednostka a i podjednostka δ są ze sobą połączone. Trzonek δε stanowi dodatkowe połączenie.
• Reakcja: ADP3- + $HPO<em>4^{2-}$ + $H^+$ → ATP4- + $H</em>2O$

Mechanizm Działania Syntazy ATP

• Związany z enzymem ATP może się tworzyć pod nieobecność siły protonomotorycznej. ATP nie opuszcza jednak miejsca katalitycznego dopóki protony nie przepływają przez enzym.
• Rolą gradientu protonowego nie jest udział w syntezie ATP ale dysocjacja ATP od enzymu.
• Mechanizm syntazy ATP oparty jest na zmianach konformacyjnych 3 podjednostek β:
  • T – stan, w którym powinowactwo do ATP jest tak duże, że synteza ATP z ADP i Pi zachodzi ze stałą równowagi bliską 1 (brak zdolności uwalniania ATP)
  • L – wiązanie ADP i Pi (brak zdolności uwalniania związanych cząsteczek)
  • O – wiązanie ADP i Pi (możliwość oddysocjowania nukleotydów)
• L→ T – synteza ATP
• T→ O – otwarcie kanału i uwolnienie ATP
• O→ L – wiązanie ADP i Pi, „uwięzienie” substratów reakcji
• Hydriloza 1 cząsteczki ATP → obrót o 120° (3 cząst. ATP/360°)
• Przepływ protonów przez F0 napędza obrót podjednostki γ

Wahadła (Czółenka)

• Wewnętrzna błona mitochondrialna jest nieprzepuszczalna dla większości cząsteczek. Czółenka umożliwiają wymianę cząsteczek między cytozolem a mitochondriami. W skład czółenek wchodzą liczne białka transportowe.
• Rodzaje czółenek:
  • Wahadło (czółenko) glicerolofosforanowe
  • Wahadło (czółenko) jabłczanowo-asparaginianowe

Czółenko Glicerolofosforanowe

• Przenoszenie elektronów z cytoplazmatycznego NADH na mitochondrialny łańcuch oddechowy.
• Elektrony z NADH wchodzą do mitochondriów za pośrednictwem systemu wahadłowego. Czółenko glicerolofosforanowe jest szczególnie aktywne w mięśniach gdzie pozwala utrzymać dużą szybkość fosforylacji oksydacyjnej.
  1. Elektrony z NADH przenoszone są na fosfodihydroksyaceton
  2. Fosfodihydroksyaceton jest redukowany do glicerolo-3-fosforanu
  3. Glicerolo-3-fosforan jest ponownie utleniany do fosfodihydroksyacetonu, czemu towarzyszy przeniesienie pary elektronów na FAD ($FADH_2$).
  4. F$ADH<em>2$ jest przez ubichinon przenoszony do łańcucha oddechowego jako $QH</em>2$.
• Reakcje 2 i 3 są katalizowane przez dehydrogenazę glicerolo-3-fosforanową zlokalizowaną w cytoplazmie.

Czółenko Jabłczanowo-Asparaginianowe

• Złożone z 2 przenośników błonowych i 4 enzymów.
• W odróżnieniu od czółenka glicerolofosforanowego, reakcje są łatwo odwracalne.

Bilans Oddechania Tlenowego

Kolejność reakcji	Wydajność ATP na cząsteczkę glukozy
Glikoliza: od glukozy do pirogronianu (w cytozolu)
fosforylacja glukozy	-1
fosforylacja fruktozo-6-fosforanu	- 1
defosforylacja 2 cząsteczek 1,3-BPG	+2
defosforylacja 2 cząsteczek fosfoenolopirogronianu	+2
podczas utleniania 2 cząsteczek aldehydu 3-fosfoglicrynowego powstają 2 cząsteczki NADH
Przekształcenie pirogronianu w acetylo-CoA (w mitochondriach)
powstają 2 cząsteczki NADH
Cykl kwasu cytrynowego (w mitochondriach)
powstanie 2 cząsteczek guanozynotrifosforanu (GTP) z 2 cząsteczek bursztynylo-CoA	+2
podczas utleniania 2 cząsteczek izocytrynianu, a-ketoglutaranu i jabłczanu powstaje 6 cząsteczek NADH
podczas utleniania 2 cząsteczek bursztynianu powstają 2 cząsteczki $FADH_2$
Fosforylacja oksydacyjna (w mitochondriach)
każda z 2 cząsteczek NADH utworzonych podczas glikolizy daje 1,5 cząsteczki ATP (z uwzględnieniem transportu NADH przez wahadło glicerolofosforanowe)	+3
każda z 2 cząsteczek NADH utworzonych podczas dekarboksylacji oksydacyjnej pirogronianu daje 2.5 ATP	+5
2 cząsteczki $FADH_2$ utworzone w cyklu kwasu cytrynowego dają po 1,5 ATP	+3
6 cząsteczek NADH utworzonych w cyklu kwasu cytrynowego daje po 2,5 ATP	+15
SUMARYCZNA WYDAJNOŚĆ NA CZĄSTECZKĘ GLUKOZY	+30

• Podczas działania wahadła jabłczanowo-asparaginianowego zostają wytworzone o dwie więcej cząsteczki ATP na cząsteczkę utlenionej glukozy, niż podczas działania wahadła glicerolofosforanowego.
• Podczas utleniania 1 mola glukozy w oddychaniu beztlenowym zysk energetyczny wynosi 2 cząsteczki ATP.