AT1 - Protein Folding, Misfolding and Associated Diseases

Controle de Qualidade e Doenças de Missfolding

O funcionamento adequado de proteinas depende de um controlo de qualidade para evitar doenças associadas a missfolding. Essas doenças ocorrem quando as proteínas se dobram inadequadamente, levando à perda de função e toxicidade celular.

Estruturas de Proteínas

Estrutura Terciária

A estrutura terciária de uma proteína é formada por interações das cadeias laterais dos aminoácidos, que incluem ligações hidrofóbicas, interações iônicas, eletrostáticas, ligações de hidrogênio e interações de Van der Waals. A formação estrutural é necessária para a função correta da proteína, pois determina a configuração espacial que possibilita a interação com outras moléculas. Renaturação desta estrutura é possível mas nem sempre ocorre

Estrutura Quaternária

Muitas proteínas são formadas por múltiplas subunidades que se associam para formar uma estrutura quaternária. Essas subunidades são mantidas juntas por uma variedade de interações, incluindo iônicas, eletrostáticas, hidrofóbicas e forças de Van der Waals. A dissociação dessas subunidades pode resultar em desnaturação e precipitação, o que compromete a atividade funcional da proteína.

Fatores que Causam Desnaturação

A desnaturação de proteínas pode ser induzida por diversos fatores, incluindo calor excessivo, alterações no pH, concentração de sal e a presença de agentes destrutivos como ureia.

Embora a renaturação seja teoricamente possível, ela não é garantida. A sequência de aminoácidos é a primeiira coisa a configurar a estrutura, pelo que a podemos tentar prever com a sequencia dos mesmos

Exemplos de Desnaturação e Renaturação

O exemplo da ribonuclease ilustra bem os processos de desnaturação e renaturação. A desnaturação resulta da exposição a agentes desnaturantes, seguida pela possibilidade de renaturação quando essas condições são removidas. Agentes redutores, como o b-mercaptanol, podem quebrar ligações dissulfureto, afetando ainda mais a estrutura da proteína.

Chaperones e o Processo de Dobra (Folding)

As proteínas chaperones são fundamentais no processo de dobra das proteínas, facilitando a formação de estruturas corretas através de ciclos iterativos. Elas guiam as proteínas a estados de energia mais baixos, ajudando a prevenir malformações.

Agregação e Formação de Fibrilas

Erros na dobra podem levar à formação de estruturas não nativas, como agregados e fibras amiloides. Agregados são mais difíceis de desfazer pois são energicamente favoráveis Estes oligômeros formados são tóxicos e interferem com os sistemas celulares, contribuindo para o desenvolvimento de doenças.

Fibrilas Amiloides

As fibrilas amiloides são resultantes da clivagem por proteases ou do empilhamento em folhas beta. Elas são caracterizadas pela formação de pontes de hidrogênio entre cadeias peptídicas e podem causar toxicidade em células. A alternância entre diferentes estruturas de proteínas pode afetar a formação de fibrilas amiloides, exacerbando a toxicidade.

Fatores que Afetam Agregação

A agregação de proteínas pode ser influenciada por diversos fatores, incluindo:

• Concentração: A concentração de proteínas desempenha um papel crítico na propensão à agregação. Em concentrações elevadas, as interações entre proteínas aumentam, podendo levar à formação de agregados.

• Estresse Oxidativo: Condições de estresse oxidativo podem danificar as estruturas de proteínas, facilitando a formação de agregados.

• pH: Alterações no pH do ambiente podem afetar a carga das proteínas, influenciando suas interações e promovendo a agregação.

• Mutações Genéticas: Modificações na sequência de aminoácidos devido a mutações podem alterar a conformação e a estabilidade das proteínas, predispondo-as à agregação.

• Modificações Pós-Traducionais: As modificações pós-traducionais são diversas e muitas vezes descontroladas, impactando a estrutura e função das proteínas. Entre essas modificações, incluem-se:

  • Fosforilação

  • Acetilação

  • Hidroxilação

  • Ubiquitinação

  • Glicolisação

Essas modificações podem ocorrer durante a síntese de proteínas ou após a tradução e são conduzidas por atividade enzimática que é variável e dependente dos fatores do meio, não sendo todas geneticamente determinadas. O que é geneticamente codificado é a presença da enzima, enquanto sua atividade pode ser regulada por fatores externos.

Estas modificações introduzem alterações nas unidades proteicas, que podem ser determinadas através de análises bidimensionais, como:

• eletroforese bidimensional (que permite observar diferentes isoformas de uma mesma proteína com diversas modificações).

• A espectrometria de massa também é utilizada para identificar pequenas alterações.

Alterações nas Proteínas e Formação de Agregados

As alterações nas proteínas que não retornam à sua conformação nativa podem levar à formação de oligômeros ou fibras.

É evidente em várias condições patológicas, como a amiloidose associada à transtiretina (TTR) e a formação de peptídeo beta-amiloide em doenças como Alzheimer, onde ocorre a formação de fibras amiloides de forma extracelular. Outro exemplo, a huntingtina, cujos agregados se formam dentro da célula, resultando em inclusões celulares que se tornam estáveis e difíceis de remover.

As doenças resultantes dessas alterações são classificadas como neurodegenerativas, e a incapacidade das células nervosas de se renovarem facilmente agrava a toxicidade, levando à degeneração celular.

Evolução para Fibras de Amiloide

O processo de formação de fibrilas de amiloide envolve espécies intermediárias, onde há formação e a perda parcial da conformação nativa. Durante esse processo, intermediários mal conformados podem coexistir com a forma nativa, e ao evoluírem para a forma desnaturada, unem-se para formar oligômeros, que posteriormente se polimerizam, resultando em fibrilas que se organizam em fibras maiores. Essa progressão é caracterizada por um período de latência, onde a proteína lenta e progressivamente se desnaturará e se agregará.

Monitoramento da Formação de Fibras

A formação de fibras de amiloide pode ser monitorada utilizando-se compostos como a tioflavina T, que se intercalam entre estruturas de folhas beta amiloide devido à sua planaridade e à natureza aromática. O aumento da fluorescência emitida pela tioflavina indica a progressão da formação de fibrilas.

Curvas de agregação podem ser comparadas para estudar o efeito de diferentes agentes nas taxas de formação de fibras.

Os gráficos mostram como aditivos influenciam a agregação: uma curva preta mais lenta está associada a maior formação de fibras - queremos evitar uma curva como esta.

Tempo de Desnaturação e Agregação de Proteínas

Durante o tempo de desnaturação, as proteínas podem esticar-se, e em algumas regiões, a estrutura pode se elevar abruptamente.

Os resultados em experiências são muitas vezes difíceis de reproduzir porque, no início, o processo é aleatório. Mesmo seguindo o mesmo protocolo sob as mesmas condições de pH e temperatura, após períodos de agregação que podem levar até 3 dias, os resultados podem variar.

As etapas intermediárias devem ser mantidas constantes, e não podemos simplesmente assumir que a agregação ocorreu após certos dias sem evidências claras.

Chaperones e Estruturas de Proteínas

As chaperones - importantes no folding correto das proteínas

em a capacidade de ligação a corantes e facilitam a formação de folhas beta. O empilhamento dessas folhas gera muitas pontes de hidrogênio, que leva a estabilidade dessas estruturas.

Corantes aromáticos, como a tioflavina e o Congo, são usados para visualizar essas formações.

Comparação In Vitro e In Vivo

As fibras formadas in vitro, onde se manipulam condições de sal ou pH, são frequentemente diferentes das que ocorrem in vivo, onde o ambiente é rico em diversas moléculas. Essas substâncias, tanto dentro quanto fora das células, podem interagir com as proteínas e influenciar sua formação e conformação.

Por exemplo, glicoproteínas como o amiloide P podem se ligar às proteínas, formando complexos.

Agregação de TTR e Estruturas Associadas

No caso da transtiretina (TTR), que apresenta múltiplas subunidades, a compreensão do processo de agregação é vital para a intervenção em doenças.

A TTR possui uma estrutura tetramérica unida por ligações não covalentes, como pontes de hidrogênio. A dissociação dessa estrutura pode levar à formação de monômeros mal formados, que se agrupam em oligômeros, e posteriormente em fibras.

O estudo dos oligômeros é crucial, pois eles se mostraram ser mais tóxicos. Esses oligômeros podem ser internalizados, interagindo com a membrana celular e seus receptores.

Caracterização de Estruturas de Agregação

A caracterização dessas estruturas pode ser feita utilizando microscopia eletrônica (ME) com coloração negativa, onde é possível observar uma clara diferenciação entre partículas em solução e agregados. Fibras aparecem claras em contraste com as partículas mais escuras.

A fluorimetria com tioflavina pode ser usada para quantificar a formação de fibras amiloides, dando uma ideia morfológica e permitindo a observação da evolução das agregações.

No entanto, a preparação para ME é mais desafiadora do que a fluorescência. As amostras devem ser analisadas com grelhas, limitando a quantidade observada, e a homogeneidade da solução pode enviesar os resultados. O uso de transplante eletrônico de transmissão (TEM) oferece análises parciais, mas ainda é restrito em comparação com a fluorescência.

Estudo de Aglomerados e Toxicidade nas Proteínas

Medição e Análise na Microscopia Eletrônica (ME)

Na microscopia eletrônica (ME), é possível medir as espécies, determinar o tamanho dos aglomerados e observar como ocorre a progressão na formação de fibras. Isso permite visualizar espécies intermediárias e identificar se são monômeros ou tetraméricos. Ao perceber se as subunidades estão associadas ou desassociadas, compreendemos a necessidade de dissociação antes da formação de fibras, o que ajuda a desenvolver estratégias para interferir na formação de agregados.

Interferência em Agregados de Amiloides

As regiões que interferem com os amiloides podem ser localizadas, e bloqueando essas áreas com diferentes peptídeos, podemos ou não obter a formação de fibras amiloides. A identificação de locais críticos de agregação permite evitar a polimerização nessas zonas, minimizando a toxicidade associada aos agregados.

Chaperones e Proteostasia

Os chaperones interferem em um processo iterativo, no qual a proteína não adquire imediatamente a estrutura adequada e pode se quebrar. Quando a estrutura correta não é alcançada, a chaperone pode interagir novamente com a proteína, promovendo um processo progressivo de dobras e dobras repetidas.

As chaperones, do grupo Hsp70, são definidas pela semelhança em suas atividades. Se não for possível eliminar os agregados, a célula tenta degradá-los por meio do proteossoma, um complexo proteico que cliva e remove fragmentos. A autofagia, um processo mais complexo envolvendo vesículas para os lisossomas com enzimas proteolíticas, também é utilizada para degradação. Caso esses mecanismos falhem, ocorre morte celular devido à toxicidade dos agregados.

O chaperon permie a externalização de grupos hidrofobicos que de outra menira estariam internalizados no meio aquoso do citosol.

Mecanismos e Desafios Relacionados

Os sistemas celulares são complexos, sintetizando entre 10.000 a 20.000 proteínas, o que resulta em um proteoma geneticamente determinado, mas também suscetível a alterações pós-traducionais. Isso traz uma maior variabilidade devido a mutações ou sínteses truncadas, levando a esta nova proteina de ser incapaz de interagir corretamente com outras proteínas, resultando em direcionamento celular inadequado.

As Hsp (proteínas de choque térmico) foram inicialmente descobertas em sistemas simples que resistem a variações de temperatura. Aumentos na temperatura desencadeiam a produção dessas proteínas, essenciais para proteger as células contra a desnaturação. Quando as Hsp não são suficientes para gerenciar a situação, a agregação de proteínas se torna um problema significativo. Portanto, compreender como as Hsp interagem com as proteínas e como os oligômeros são tratados dentro da célula é crucial para manter a proteostasia e evitar a toxicidade.

Cilo de vida de um polypeptido: processo acompanhado por varias proteinas e ocorre em diferentes locais da celula. é controlado e contribui para a homesostasia

Para que a celula funcione bem, ´´e necessário um equilibrio da sintese proteica, folding e recuperação de folding. Quando não está em equilibrio têm de funcionar sistemas de recuperação para refolding ou podem formar agregados que são depois removido por sistemas de clearance como via de autofgia e proteossoma

O problema de folding é ainda mais importante em proteinas grandes, há medida que as proteinas são sintetizadas. As proteinas grandes são sintetizadas e vão surgindo à supreficie do ribossoma, vai adquirindo uma estrutura que é detetada pela sequencia exposta. A extremidade da proteina vai sempre ficar à supreficie e na parte externa da proteina. A proteina que vai imergindo vai ser acompanhada e vao proteger a proteina do meio e que o folding vai sendo adquado ha medida que vai surgindo, controlo por proteinas. A proteina grande adquire a sua conformação final

Os processos de acompanhamento acontecem durante a sintese da cadeia mas mesmo depois de sintese a proteina pode ainda sufere mais alterações por outras chaperons. Muitos sistemas que acompanham a proteina num processo continuo.

Quando uma roteina interage com uma chaperon, nao indica que é logo estavel, pode preciar de mais chaperons.

Contribuiem varias chaperons, logo â saida do ribossomas, proteinas de chocktermico e portante existem depois tb outros sistemas que, as proteinas podem entrar em contacto com toos os chaperons e não aquirir a sua conformação e agregar

A celula vai ter que reagir a estes fenomenos neste processo. Vários sistemas de folding de proteinas involvendo chaperons, descobertas em microorganismos

sistema em eukariotas e bacterias

Há equivalentes no sistema eucariotas

Complexo NacRac - folding logo a saida

sistema de proteinas prefoldina - chaperon em contacto com proteinas em folding, conduz para a HSP70 (zonas hidrofobicas expostas na proteina que deveriam estar protegidas e estabilizam a proteina. Interage com HSP40 - refolding)

Podem ainda ser mais moldadas pelo complexo tric - complexo de chaperoninas ligadas a HSP60, “nanocapsulas” onde a proteina entra e sofre alterações conformacionais. Podem ser direcionadas pela prefoldina diret<mente. HSP90 - proteinas de sinalização e com confromações intermédias, proteinas cinases e necessitam de contacto para não se ativarem

Chaperons aqui - refolding de proteinas para manutenção da extrutura das proteinas que pode ser imediatamente ao sintese ou logo após ou refolding de alteração de conformação das condições da celula e necessita de refolding.

HSP70 pode resultar numa proteina logo diretia mas pode ainda n estar na sua forma adquada e pode voltar ao sistema e repetir o ciclo.

Ligação de interação da proteina que está parcialmente enrrolada com HSP70 e HSP40 e depois do restaurar da informação da proteina nativa

Processos reversiveis e pode evoluir na restruturação da proteina, tem custo energetico.

Chaperoninas (esquema) usa atp interage com a região de entrada e fica num ambiente protegido de HSP70 e aqui interage com a proteina chaperonina e altera a sua conformação. tem ainda uma subunidade que fecha este ambiente. São tb induzida por ATP nas chaperoninas e a proeina adquire a conformação, hidrolise de ATP abre a capsula e saida da proteina. este sistema complexo contribui para evitar a agregação.

HSP90

funcionam como uma pinça que liga a proteina entre os dois braços e vão involver a proteina e levar à sua reconformação. recetores usa atp

Para alem destes sistemas:

Foldin assistido em reticulo endoplasmatico, lá ha outros processos que envolvem alterações pós tradução e recossão de peptidos sinais.

Folding assistido temos chaperons, enzimas, enzimas que clivam epetido sinal e enzimas envolvidas na adição de alterações pos tradução para alem de glicosilações e podem ocorrer em divererntes organelos, RE e Golgi - N glicoli no reticulo e o O-glicolização- N são mais interior, o N das asparaginas e o O tem haver com ligação de açucars nos carboxilos, em serinas e trioninas. acontece durante o processo de tradução a N enquanto que a O acontece após sintese e é supreficial. Processos de desicolização? tirar açucares é mais facil nos açucares O do que os N. Os O resulta em menor altereação extrutural

Formação de pontes de dissulfureto nas cistenias (interações covalentes que contribuem para a conformação. Oxidoredutases e PDI …

Quando os sistemas não funcionam e a proteina não recuperou a sua extrutura ou função tem se ser degradada - sistemas de degradação ao reticulo - erad

ERAD - RE para citosol e marcadas por ubiquitinação e proteossoma - UPS

CFTR - proteina memebranar de um canal de sodio - fibrose cistica - proteina grande que é bem conhecida e muitas das suas mutações - determinação da estruturas e funções.

Temos representado o processo de ubiquitinação

UPS - ubiquitinação que leva a degradação de proteinas misfolded

Ubiquitinação reconhecida nas unidades periferias, leva ao interior com proteases e são libertados os aminoacidos resultantes.

Representadas as diferentes abordagens da celula para reagir à sintese proteica com os diferentes mechanismos de chaperons e levando à conformação da proteina de forma adquada. Stress da celula - agregados que podem ser removidos por proteossoma e mecanismos de autofagia.

Processos comuns acontecem naturalmente das celulas podem levar a um sistema de doenças. Porque que elas são doentes.

Equilibrio proteico a nivel extracelular. Há proteinas involvidas. Pode ser secretada para o meio exterior de forma normal e sofrer alterações no exterior - meio que levam ao unfolding, ph sal, etc.

tb este ambiente extracelular colaboram com a recoperação das proteinas. Diferentes do intracelular, o intra é dependendte de energia e energeticamente é desvaforavel e é diferente da interação intracelular e extracelular. O folding de proteinas n depende de atp no exterior. Interagem com as proteinas mal folded e estas chaperons protegem as regiões e facilitando reconformação e se esta interação se mantem e a proteina não se libertou, elas direcionam as proteinas para dar uptake e processar as proteinas. Plasmina, protease de serina e pode interagir e debraar agregados, refolding redirecionamento para um determinado da celula ou orgão ou a sua agregação.

Chaperons extracelulares

clusterinas, haptoglobina, alfa macroglobina, caseinas, outras. Envolvidas em doenlas de agregação, freuqente e ubiqua. interagem comvarias proteinas e tem refolding com varias proteinas. As proteinas atuam sobre proteinas mal conformadas e tem de ser removidas e refolded no meio extracelular.

efeitos toxicos diret de agregados, desencadeamento de inflamação para as celulas adquadas e processos de endocitse da proteina mal confromada

podem atuar de diferentes modos.

Quando é que os mecanismos atuam. num sistema saudavel, numa situação de stress é temporaria em que a celula tem mecanismos de forma mais intensiva - ainda mantem a homeostasia. Envelhecimento e doença - incapacidade da recuperação do equilibrio que acontece por missfolding proteico. Os mecanismos da celula ou do organismo não são sufcientes para manrer homeostasia proteica.

Alterações em proteinas por alterações geneticas que levam a alteração da estrutura proteica

Agregação celular em alzheimer, agregação de TAU e extracelular com a formação de depositos de amiloide de peptido a-Beta

Doenças associadas a intra e extra agregados

Amiloidoses transcriptina?- é menos relevante em termos fenotipicos o sistema nervoso central

Formas herditárias ou formas não hierditarias e maioria pelo invelhecimento

Agregação de proteinas é um processo progressivo e leva à polimerização da proteinas e polimeriza para a formação de fibras. Os estudos in vitro de toxicidade verifica-se que ao utilizar proteinas de formas iniciais de agregados são em geral as formas mais toxicas, e as fibras são menos toxicas - in vitro!! Numa fase inicial as formas são muito toxicas interagem com recetores a nivel membranar e desencadeiam uma serie de reações intracelulares que são processos de resposta e são muito toxciso para as celulas.

Formação de agregados - toxcios - got it

Tabela com as doenças, agregações e fenotipico, e tecidos afetados

Outra tabela - nomeadamente a nivel de toxicidade.

Inicialmente pensavamos que muitas destas doenças estão relacionadas com mutações. E isso acontece, mas muitas destas alterações são alterações das condições das proteinas com tendencia a aletração da confromação da proteina e desencadear da doença. Em geral leva algum tempo a desenvolver e está relacionado com o seeding - efeito de exsitencia de especies instaveis precoses vai facilitar a formação de mais especies instaveis e a sua polimerização.

Estrutura Beta, proteinas com extensa estrutura beta tem maior propenção para agregação devido a tendencia para empilhar folhas betas que tem tendencia de formar fibras. A amiloide é agregação organizada de proteinas. Neste caso, as proteinas envolvidas formam depositos regulares proteicos.

Concentração de proteinas, quanto mais concentrado maior é a propensão para agregar, prteinas com baixa concentração tb por falta de meio para folding correto.

A alteração de pH, protonação da proteina

modificações pos tradução, a fosforilação da tau

glicosilação do prion

poliaminação tb leva a agregação de proteinas assim como a clivagem da proteina

alterações de aa