Umfassende Studiennotizen zur Histologischen Technik und Mikroskopie

Grundlagen der Kameratechnik in der Mikroskopie

  • ROI (Region of Interest)

    • Ein kleinerer Bildausschnitt f%C3%BChrt zu einer geringeren Datenmenge.
    • Resultat ist eine h%C3%B6here Bildrate.

  • Binning

    • Mehrere Pixel werden zusammengefasst.
    • Dies f%C3%BChrt zu einer h%C3%B6heren Empfindlichkeit und Geschwindigkeit.

  • Einchipkamera

    • Arbeitet mit einem Bayer-Filter.
    • Nutzt Farbinterpolation zur Bilddarstellung.

  • Dreichipkamera

    • Verwendet drei separate Sensoren und ein Prisma.
    • Erm%C3%B6glicht h%C3%B6chste Farbgenauigkeit ohne die Notwendigkeit einer Interpolation.
    • Vorteile:
      • Sehr hohe Aufl%C3%B6sung.
      • Exakte Farbwiedergabe durch Aufteilung des Lichts in Rot, Gr%C3%BCn und Blau mittels Prisma.
      • Jeder Bildpunkt erh%C3%A4lt vollst%C3%A4ndige RGB-Werte.
    • Nachteile:
      • Teurer in der Anschaffung.
      • Komplexer technischer Aufbau.
      • Geringere Lichtempfindlichkeit.

Materialgewinnung und Fixierung

  • Gewinnung der Probe

    • Biopsie: Entnahme einer kleinen Probe lebenden Gewebes.
    • Ektomie: V%C3%B6lliges Entfernen eines Organs.
    • Resektion: Operative Teilentfernung.

  • Zweck der Fixierung

    • Erhaltung des Ist-Zustandes der Zelle (Stopp des Zellstoffwechsels).
    • Stopp von Autolyse- und F%C3%A4ulnisprozessen (Nekrose nach Sauerstoffmangel).
    • Konservierung von Gewebeaufbau, Strukturen und Zellkomponenten.
    • Erhalt der Nachweisbarkeit von Zellinhalten (Antigenintegrit%C3%A4).
    • Begrenzung von Extraktion, Diffusion und Verdr%C3%A4ngung.
    • Stabilisierung f%C3%BCr nachfolgende Schritte wie Dehydrierung und Einbettung.

  • Anforderungen an Fixiermittel

    • Schnelle Durchdringung des Gewebes.
    • Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.
    • Freilegung von Epitopen (oder zumindest Erm%C3%B6glichung der Demaskierung).
    • Unempfindlichkeit gegenüber pH-Wert, Temperatur und Zeit.
    • Preiswert und einfach zu entsorgen.
    • Gesundheitliche Unbedenklichkeit (in der Praxis oft nicht erf%C3%BCllt).

  • Methoden der Fixierung

    • Thermische Fixierung (Hitzefixierung):
      • Mittels Flammen oder Mikrowellen.
      • H%C3%A4ufig in der Mikrobiologie genutzt (z. B. Gramf%C3%A4rbung von Bakterienausstrichen).
    • Kryofixierung (Gefrierfixierung):
      • Sehr schnelles Einfrieren (z. B. mit fl%C3%BCssigem Stickstoff), um Eiskristallbildung zu vermeiden.
      • Vorteile: Sehr guter Strukturerhalt, keine Proteindenaturierung, geeignet f%C3%BCr empfindliche Enzyme.
      • Anwendung: Schnellschnitte; kein Einbetten n%C3%B6tig, erfordert aber konstante tiefe Temperaturen.

Chemische Fixierung

  • Gerinnungsmittel / Koagulantien

    • Wirkungsweise: Entzug der Hydratationsh%C3%BClle von Proteinen; hydrophobe Bereiche gelangen nach au%C3%9Fen.
    • F%C3%BChrt zur Denaturierung und Zerst%C3%B6rung der Terti%C3%A4rstruktur.
    • Beispiele: Alkohole (Methanol, Ethanol, Isopropanol), Aceton, Salze (Ammoniumsulfat).
    • Vorteile: Schnelles Eindringen, guter Erhalt von Antigenbindungsstellen, gut f%C3%BCr Ausstriche und Enzymnachweis.
    • Nachteile: Starkes Schrumpfen des Gewebes, schlechte Morphologieerhaltung, Extraktion von Lipiden und Membranproteinen.

  • Vernetzungsmittel

    • Wirkungsweise: Bildung kovalenter Bindungen innerhalb und zwischen Molek%C3%BClen.
    • Formaldehyd:
      • Standard: Neutral gepufferte, w%C3%A4ssrige L%C3%B6sung (ca. 4 %4\,\% bei pH 7,4).
      • Vorteile: Wenig denaturierend, Sekund%C3%A4rstruktur bleibt erhalten, desinfizierend, schnelle Penetration, kaum Schrumpfung.
      • Nachteile: Giftig, ätzend, karzinogen; vernetzt keine Lipide; löst niedermolekulare Kohlenhydrate.
    • Glutaraldehyd:
      • Bifunktioneller Vernetzer, bildet Polymere.
      • Vorteile: Zellstruktur sehr gut erhalten; ideal f%C3%BCr die Elektronenmikroskopie.
      • Nachteile: Macht Gewebe spr%C3%B6de, deformiert α\alpha-Helices; verursacht unerw%C3%BCnschte Eigenfluoreszenz.

Wirkungen auf biologische Makromolek%C3%BCle und Fehlerquellen

  • Proteine: Formaldehyd stabilisiert Peptide; Alkohole f%C3%BChren zur Denaturierung.

  • Kohlenhydrate: Glykogen wird oft durch den Proteinanteil mitfixiert. Alkohole f%C3%A4llen Kohlenhydrate aus.

  • Lipide: Werden durch organische L%C3%B6sungsmittel extrahiert. Fixierung m%C3%B6glich durch Vernetzung unges%C3%A4ttigter Lipide mit Osmiumtetroxid.

  • Nukleins%C3%A4uren: Stabilisierung der r%C3%A4umlichen Anordnung durch Fixierung des Proteinanteils (z. B. Histone).

  • Technische Probleme und Artefakte:

    • Schrumpfung/Quellen: Durch osmotische Effekte.
    • Substanzflucht: Konzentrationsverschiebung weg von der Eindringrichtung.
    • Überfixation: Zu starke Vernetzung erschwert die Demaskierung von Antigenen.
    • Autolyse: Tritt auf, wenn die Zeit zwischen Entnahme und Fixierungsstart zu lang ist.

Dehydrierung, Clearing und Einbettung

  • Dehydrierung (Entw%C3%A4ssern)

    • Überf%C3%BChrung von w%C3%A4ssriger Umgebung in hydrophobes Paraffin.
    • Durchf%C3%BChrung mittels einer aufsteigenden Alkoholreihe (z. B. Ethanol 70 %70\,\% %E2%86%92 80 %80\,\% %E2%86%92 90 %90\,\% %E2%86%92 100 %100\,\%).

  • Clearing (Aufhellen)

    • Intermedium zwischen Alkohol und Paraffin (beides muss mischbar sein).
    • H%C3%A4ufig verwendet: Xylol.
    • Effekt: Macht das Gewebe durchscheinend, da der Brechungsindex angepasst wird.

  • Einbetten

    • Anforderungen an das Medium: Schmelzpunkt zwischen 30 – 60 ∘C30\,\text{--}\,60\,^\circ C, homogene Infiltration, stabil bei Lagerung, ungiftig.
    • Paraffin ist das g%C3%A4ngigste Medium.

Schneiden und Mikrotomie

  • Schnittdicke

    • Lichtmikroskopie: 0,5 – 6 μm0,5\,\text{--}\,6\,\mu m (m%C3%B6glich bis 300 μm300\,\mu m).
    • Elektronenmikroskopie (EM): 0,01 – 0,5 μm0,01\,\text{--}\,0,5\,\mu m.
    • Dichtes Gewebe (Niere, Lymphknoten): 1 – 2 μm1\,\text{--}\,2\,\mu m.
    • Hartes Gewebe (Knochen): 5 – 8 μm5\,\text{--}\,8\,\mu m.

  • Arbeitsschritte beim Schneiden

    1. Bl%C3%B6ckchen k%C3%BChlen.
    2. Objekttr%C3%A4ger beschriften.
    3. Messer und Block einspannen.
    4. Anschneiden und Feinschneiden.
    5. Schnitt im Wasserbad strecken.
    6. Aufziehen auf Objekttr%C3%A4ger und Trocknen.

  • Mikrotom-Typen

    • Schlittenmikrotom: Messer beweglich auf horizontaler Ebene.
    • Rotationsmikrotom: Messer fixiert, Probe beweglich; ideal f%C3%BCr Serienschnitte.
    • Kryostat: Rotationsmikrotom in einer K%C3%BChlkammer (bis −60 ∘C-60\,^\circ C).
    • Ultramikrotom: F%C3%BCr EM-Schnitte (0,01 – 0,5 μm0,01\,\text{--}\,0,5\,\mu m).

  • Haftvermittler (Adh%C3%A4sive)

    • Eiwei%C3%9F-Glycerin oder Gelatine.
    • Silanisierte Objekttr%C3%A4ger (Aminogruppen).
    • Poly-L-Lysin (positiv geladen).

Antigen-Demaskierung und Vorbereitung

  • Demaskierungsmethoden

    • PIER (Proteolytically Induced Epitop Retrieval): Verdau mit Enzymen wie Proteinase K (z. B. 10 min⁡10\,\min bei RT), Trypsin oder Pepsin.
    • HIER (Heat-Induced Antigen Retrieval): Einwirkung feuchter Hitze (≈100 ∘C\approx 100\,^\circ C) in Puffern (pH 2–10pH\,2\text{--}10) f%C3%BCr 30 – 45 min⁡30\,\text{--}\,45\,\min. Verwendet werden Citratpuffer (pH 6pH\,6) oder EDTA-Puffer (pH 9pH\,9).

  • Permeabilisierung

    • Einsatz von Detergenzien zur Erh%C3%B6hung der Membrandurchl%C3%A4ssigkeit.
    • Triton-X-100: Starkes Detergenz (0,5 %0,5\,\%), durchbricht Membranen.
    • Tween 20 / Saponin: Mildere Detergenzien; lassen Plasmamembranen weitgehend intakt.

  • Blockierung

    • Unspezifische Bindungen: Abs%C3%A4ttigung mit Normalserum, BSA oder Milchpulver.
    • Endogene Enzyme: Wichtig bei enzymgekoppelten Reaktionen. Endogene Peroxidasen (z. B. in Erythrozyten, Leber) werden mit 3 %3\,\% H2O2H_2O_2 blockiert, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden.