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Spectrometrie de masse

Mass Spectrometry is an analytical technique used to determine the mass-to-charge ratio of ions. It is commonly used in chemistry and biochemistry for identifying compounds and studying molecular structures.

Mass Spectrometry is used in protein analysis to determine the mass of proteins and peptides, identify post-translational modifications, sequence proteins, and study protein-protein interactions. It helps in characterizing complex protein mixtures and understanding their structures.

MALDI-TOF Technique:MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight) is a mass spectrometry technique used for analyzing biomolecules like proteins and peptides. It involves ionizing samples with a laser and measuring their time of flight to determine their mass-to-charge ratio.

MALDI-TOF Technique:

The MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight) technique is a powerful tool in the field of mass spectrometry, particularly for the analysis of biomolecules such as proteins and peptides. This technique revolutionized the way researchers study complex biological samples due to its high sensitivity and accuracy.

In MALDI-TOF, the process begins by applying a matrix compound to the sample, which helps in the ionization process. The sample is then irradiated with a laser, causing the molecules to become ionized. These ionized molecules are accelerated in an electric field and then enter the flight tube, where they travel based on their mass-to-charge ratio.

The time taken by the ions to reach the detector at the end of the flight tube is directly proportional to their mass-to-charge ratio. By measuring the time of flight, the mass-to-charge ratio of the ions can be determined accurately. This information is crucial in identifying and characterizing the biomolecules present in the sample.

MALDI-TOF has found applications in various fields such as proteomics, clinical diagnostics, and drug discovery. Its ability to rapidly analyze complex mixtures of biomolecules with high sensitivity has made it an indispensable tool in modern research laboratories. Researchers can obtain detailed information about the molecular composition of samples, aiding in the understanding of biological processes and disease mechanisms.

Overall, the MALDI-TOF technique has significantly advanced the capabilities of mass spectrometry, offering researchers a powerful method for studying biomolecules and unraveling the complexities of biological systems.

Applications en Maldi Tof - MS

Def : La spectrométrie de masse est une technique d'analyse physico- chimique permettant de détecter, d'identifier et de quantifier des molécules d’intérêt par mesure de leur masse. Dans certains cas, La spectrométrie de masse permet de caractériser la structure chimique des molécules en les fragmentant (MS/MS).

Principe : Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge m/z. Necessité que ca soit un gaz chargé.

Un spectromètre de masse mesure la masse de molécules isolées

Il assure les opérations suivantes:

1- Volatiliser

Séparer les molécules les unes des autres sous forme d’état gazeux

2- Ioniser

Transformer les molécules en ions, car un spectromètre de masse fonctionne grâce à des champs électriques.

3- Mesurer les rapports m/z

La masse moléculaire est calculée à partir du rapport

masse(m) / nombre de charge (z)

Après purification l’echantillon est sous forme liquide ou dans certains cas en poudre. Il faut donc le rendre gazeux grace a une spectrometrie. Une fois les ions produits on les passe dans un analyseurs pour les séparer et detecter puis analyser le signal afin de s’assurer que la bonne protéine est purifiée.

La source d’ionisation d’intérêt dans notre etude est la source MALDI qui a besoin d’une source laser assistée par une matrice. On piège la prot dans la matrice (cf diapo rond bleu et plot rond jaune). La matrice absorbe a la longueur d’onde du laser, elle est acide et photo sensible. ce qu’on mesure c’est M(H+).

La difference entre les matrices (HCCA pour les peptides) est la repartition de l’echantillon au sein de la matrice. En fonction du programme utilisé (automatique ou manuel) certaines matrice sont plus interessante.

L’autre source 'd’ionisation est l’ESI mais on s’en fout un peu là. Elle rend les ions multi chargé ce qui est un peu plus compliqué pour le reste de l’analyse. Plus on ralenti la course des ions meilleurs sera la resolution.

Time-of-Flight (TOF) Analysis:TOF analysis is a technique used in mass spectrometry to determine the mass-to-charge ratio of ions. It measures the time taken for ions to travel a known distance, allowing for accurate mass determination.

Time-of-Flight (TOF) Analysis Process:

  1. Ionization: Sample molecules are ionized to form ions by techniques like electrospray ionization or matrix-assisted laser desorption/ionization.

  2. Acceleration: The ions are accelerated to a constant kinetic energy using an electric field.

  3. Flight Path: Ions travel through a flight tube towards a detector, with lighter ions moving faster than heavier ones.

  4. Detection: The time taken for ions to reach the detector is recorded.

  5. Mass Calculation: Mass-to-charge ratio is determined by analyzing the flight time, allowing for accurate mass determination of the ions.

BLG , pour 20 000 Da on prend une gamme de masse de 50 000 Da environ pour être large.

La résolution R : est la capacité d’un instrument à distinguer entre eux, deux signaux voisins.

Lecture de la fiche uniprot :

info importante :

  • nombre d’AA

  • Sequence

  • Masse moléculaire - Masse mono isotopique

  • lieu d’expression/secretion donc signal de secretion (162 residue après retrait du peptide signal - attention au soucis de numérotation)

  • pont disulfure

  • rôle

  • fixe n’importe quel molecule hydrophobe

  • presence de variant - pour une meme sequence on a plusieurs prot. Uniprotkb choisi un seul variant car c’est une bade de données non redondantes.

  • propriété allergenes

I l nous faut des peptides en 500 et 3000, pour la BLG la digestion tropique donne ces résultats donc c’est bon mais des fois il faussaire une autre digestion

Cristallisation

Pas de limite de tailles mais nécessite d’avoir des cristaux