metody posiewu

Temat 6: Metody posiewu i hodowli drobnoustrojów

Literatura

  • Kocwowa E.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej dla wyższych szkół technicznych. PWN 1984.

    • str. 50-58 (Pożywki mikrobiologiczne)

    • str. 86-92 (Wyosabnianie czystych kultur drobnoustrojów)

    • str. 101-103 (Hodowla kłuta, stosunek do tlenu)

    • str. 135-141 (Metody hodowli drobnoustrojów)

Cele ćwiczenia

Aby zaliczyć to ćwiczenie, student powinien:

  • znać podstawowe wymagania pokarmowe mikroorganizmów autotroficznych i heterotroficznych;

  • wiedzieć, w jakim celu wykonuje się poszczególne typy posiewu;

  • znać kryteria podziału pożywek z podaniem przykładów i krótką charakterystyką;

  • wiedzieć, czym jest agar, agar odżywczy, bulion i żelatyna;

  • umieć scharakteryzować mikroorganizmy według ich wymagań dotyczących:

    • temperatury

    • odczynu

    • natlenienia

    • ciśnienia osmotycznego;

  • znać metody hodowli w warunkach beztlenowych;

  • umieć scharakteryzować podstawowe typy hodowli, w tym fazy hodowli statycznej;

  • rozumieć różnicę między hodowlą statyczną a ciągłą;

  • rozumieć pojęcia takie jak: posiew, inokulum, szczep, izolacja szczepu, czystość w sensie mikrobiologicznym, kolonia, inkubacja, autotrofy, heterotrofy, prototrofy, auksotrofy, mikroorganizmy psychrofilne, mezofile, termofilne, tlenowce, beztlenowce, względne beztlenowce, mikroaerofile, czas generacji, wzrost logarytmiczny, chemostat, jednostka tworząca kolonię (jtk, cfu);

  • umieć wykonać podstawowe typy posiewu, w tym wyizolować czysty szczep;

  • umieć wykonać ciąg rozcieńczeń.

Definicje i pojęcia związane z hodowlą drobnoustrojów

  • Inokulum (zaszczep): Posiane mikroorganizmy, które wprowadzono do sterylnej pożywki.

  • Czas inkubacji: Czas, w którym posiane drobnoustroje pozostają w pożywce, w celu wzrostu.

  • Szczep: Zbiór komórek pochodzących z jednej komórki macierzystej, uzyskany z hodowli.

  • Czysty szczep: Zbiór komórek uzyskany tylko z jednego szczepu, przydatny do dalszych badań.

Cele posiewu

  • Wyizolowanie drobnoustrojów z prób środowiskowych (woda, gleba) w celu dalszych badań, np. identyfikacji.

  • Namnożenie komórek już wyizolowanego szczepu: np. w celu wydobycia ich metabolitów lub zbadania ich zdolności do degradacji zanieczyszczeń.

  • Policzenie komórek zawartych w posiewanej próbie.

Wymagania pokarmowe

  • Mikroorganizmy potrzebują źródła energii, węgla, azotu oraz innych składników pokarmowych, co określają symbole chemiczne:

    • CHOPKNS: C, H, O, P, K, N, S (węgiel, wodór, tlen, fosfor, potas, azot, siarka).

  • Oprócz tego, wymagane są pierwiastki w małych stężeniach, takie jak żelazo, magnez oraz pierwiastki śladowe (Co, Mn, Zn, Cu, Mo, Ca).

    • Autotrofy: Źródłem energii są promieniowanie słoneczne (fotoautotrofy) lub energia utleniania zredukowanych związków nieorganicznych (chemoautotrofy), a węgla - CO2.

    • Heterotrofy: Źródłem energii i węgla są związki organiczne.

    • Podział heterotrofów:

      • Prototrofy: wymagają jednego rodzaju organicznych związków węgla.

      • Auksotrofy: potrzebują przynajmniej dwóch rodzajów związków organicznych.

Rodzaje pożywek

  1. Podział według konsystencji:

    • Płynne

    • Stałe

    • Półpłynne

    • Bulion odżywczy:

      • Mieszanina peptonu, wyciągu mięsnego, NaCl.

      • Używany do namnażania komórek.

  2. Zestalanie pożywek:

    • Agar: Mieszanina agarozy i agaropektyny, używana w ilości 1,5-2%.

    • Żelatyna: Białko kostne, rozpuszczające się w temp. ok. 30-35°C.

  3. Podział według wymagań pokarmowych:

    • Pożywki proste: Zaspokajają podstawowe wymagania pokarmowe.

    • Pożywki wzbogacone: Dla bardziej wymagających drobnoustrojów, np. wzbogacone o krew lub wyciągi.

    • Pożywki specjalne: Dla drobnoustrojów z wyjątkowymi wymaganiami.

    • Pożywki wybiórcze: Umożliwiają wzrost określonym drobnoustrojom, hałasu wzrost innych mikroorganizmów.

Warunki wzrostu drobnoustrojów

Temperatura

  • Temperatury kardynalne:

    • Minimalna: Poniżej której wzrost nie następuje.

    • Optymalna: Najlepsza temperatura dla wzrostu.

    • Maksymalna: Powyżej której wzrost nie następuje.

  • Podział:

    • Psychrofilne: Optimum ok. 20°C (minimum -10°C, maksimum 30°C).

    • Mezofilne: Optimum ok. 37°C (minimum 15°C, maksimum 45°C).

    • Termofilne: Optimum ok. 55°C (minimum 30°C, maksimum 75°C).

Odczyn

  • Preferowany odczyn:

    • Większość bakterii: pH 7 - 7,5 (lekko zasadowy).

    • Grzyby: pH 5,2 - 5,6 (kwaśny).

Natlenienie

  • Podział:

    • Bezwzględne tlenowce: Wymagają tlenu.

    • Bezwzględne beztlenowce: Nie tolerują tlenu.

    • Względne beztlenowce: Można hodować w obecności i bez obecności tlenu.

    • Mikroaerofile: Wymagają niskich stężeń tlenu.

Ciśnienie osmotyczne

  • Większość drobnoustrojów rośnie w roztworach izotonicznych.

  • Umożliwiają przetrwanie w różnych zakresach stężeń soli.

Rodzaje hodowli

  • Stabilne (okresowe): Wzrost do wyczerpania pożywki.

  • Ciągłe: Rotacyjny proces z ciągłym usuwaniem produktów przemiany i dodawaniem świeżej pożywki.

  • Zsynchronizowane: Komórki dzielą się synchronicznie.

Część praktyczna

Zadanie 1: Posiew izolacyjny na podłoże stałe (agar odżywczy)

  • Cel: Wyizolowanie czystych szczepów drobnoustrojów.

Procedura:

  1. Wyżarzyć ezy.

  2. Pobrać zawiesinę bakterii i rozprowadzić po powierzchni agaru.

  3. Incubacja w temp. pokojowej przez kilka dni.

  4. Ocenić efekty posiewu.

Zadanie 2: Posiew ezą na skos agarowy

  • Celem jest przechowywanie różnych szczepów.

Procedura:

  1. Wyżarzyć i schłodzić ezę.

  2. Pobrać szczep i rozprowadzić na skosie.

  3. Inkubacja w temp. pokojowej przez kilka dni.

Zadanie 3: Posiew na podłoże płynne (bulion odżywczy)

  • Cel: Określenie stosunku bakterii do tlenu.

Procedura:

  1. Przenieść zawiesinę bakterii do bulionu.

  2. Inkubacja przez kilka dni.

Zadanie 4: Posiew na podłoże płynne fermentacyjne

  • Cel: Badanie zdolności fermentacji.

Procedura:

  1. Pobrać szczep i przenieść do pożywki.

  2. Inkubacja w odpowiedniej temperaturze.

Zadanie 5: Posiew metodą kłutą na słupek agarowy z TTC

  • Foremki badania zdolności ruchu.

Procedura:

  1. Zaszczepić słupek.

  2. Inkubacja przez tydzień.

Zadanie 6: Posiew metodą kłutą na słupek żelatynowy

  • Badanie zdolności hydrolizy białek.

Zadanie 7: Posiew metodą wgłębną na płytki Petriego

  • Badania ilościowe.

Procedura:

  1. Przygotować rozcieńczenia.

  2. Wylać do płytek.

Zadanie 8: Posiew metodą powierzchniową głaszczką na podłoże stałe

  • Cel: Badania ilościowe, hodohwa tlenowa.

Procedura:

  1. Rozcieńczyć próbę.

  2. Przeprowadzić posiew na płytki.