9. Microscopia Course Arquitetura Molecular

9. Microscopia 

Primeiro microscópio - Países Baixos em ~1590 

tubo com 2 lentes - total magnificação de 9x 

Anton van Leeuwenhoek - primeiro microscópio propriamente dito 

magnificação de 270x 

primeira observação de bactéria, leveduras e fluxo sanguíneo em capilares Características da luz 

Refração da luz: 

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ocorre quando a luz passa de um 

meio para outro de diferente 

index de refração 

refração num prisma equilateral 

separa a luz nos seus diferentes 

comprimentos de onda - desde 

os mais curtos (luz azul) aos 

maiores comprimentos de onda 

(luz vermelha) 

dispersão - variação no ângulo 

de desvio  

Reflexão da luz: 

ocorre quando a 

onda encontra uma 

superfície ou limite 

onde a energia de 

radiação não é 

absorvida e 

portanto reflete-se 

Há dois tipos de 

reflexão - a 

especular e a difusa 

Difração da luz: 

ocorre quando uma onda de luz 

atravessa uma fenda ou um canto 

com aproximadamente o mesmo 

tamanho (ou inferior) do 

comprimento de onda da luz 

9. Microscopia 2

As ondas de luz possuem campos 

elétricos que vibram em todos os 

planos perpendiculares em relação à 

direção de propagação. 

Após a filtragem com um polarizador, 

os vetores de campo elétrico são 

restringidos a um único plano e todas 

as ondas vibram no mesmo plano – 

luz polarizada. 

As ondas de luz podem interferir umas com as outras. Essa interferência pode ser observada em bolhas de sabão ou em películas de óleo flutuando na água. 

As cores derivam da reflexão simultânea da luz nas superfícies interna e externa da bolha. 

Se as ondas de luz estiverem se 

propagando na mesma direção e 

plano, elas podem interferir 

construtivamente (cores brilhantes) 

ou destrutivamente (cores escuras). 

Cores 

Primárias - vermelho, verde e azul 

são as cores fundamentais para a 

visão humana 

bebés normalmente só 

conseguem distinguir as entre 

estas cores 

Complementares - ciano, magenta e 

amarelo 

são complementares pois 

resultam da adição de branco a 

cada uma das cores primárias 

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Primary subtractive colours 

Microscopia 

Condições necessárias: 

magnificação  

resolução 

contraste - permite distinguir objetos do fundo (diferentes propriedades óticas) 

técnicas para aumentar o contraste: 

absorção 

index de refração (scattering, light shift. refraction) 

emissão (fluorescência) 

outros (birrefringência, reflexão, etc) 

Estas condições têm de acontecer SIMULTANEAMENTE para a correta 

interpretação dos objetos observados 

Muitas fontes de luz emitem radiação que cobre todo o espectro visível. No entanto, muitas vezes é necessário produzir luz com um espectro de 

comprimento de onda restrito. 

Filtros de cor podem ser usados para 

transmitir seletivamente os 

comprimentos de onda desejados, 

enquanto restringem outros. 

Filtros de absorção podem absorver 

os comprimentos de onda 

indesejados, permitindo que outros 

passem. 

Os filtros de interferência diferem 

dos filtros de absorção pelo fato de 

que eles refletem e interferem 

destrutivamente com os 

comprimentos de onda indesejados, 

em vez de absorvê-los. 

9. Microscopia 4

Filtro dicróico: cores diferentes em 

cada lado devido ao revestimento de 

filme fino em múltiplas camadas. 

Resolução - distância mais pequena entre dois pontos ou objetos que ainda pode ser distinguida pelo observador ou pela câmara como objetos distintos 

o que nós queremso é SEMPRE o limite de resolução mais baixo 

a resolução axial é sempre pior do que a horizontal 

limite horizontal = 200nm 

limite axial = 800nm 

Aumento da resolução: 

abertura da objetiva determina quanta luz vai entrar, contribuindo para uma melhor resolução e formação de imagem 

líquido de imersão reduz o indíce de refração, permitindo à luz viajar com muito pouca alteração 

Objetivas de imersão apresentam maior abertura numérica (NA) e portanto mais luz entra na objectiva 

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Disco Airy - espaço de luz com melhor foco que uma lente “perfeita” pode criar a uma dada abertura 

um disco Airy mais pequeno significa que o raio do disco é tb mais 

pequeno e a resolução maior 

Padrão Airy - corresponde a um padrão de difração 

Medida de distorção de imagem (point spread function - PSF) 

disco Airy é uma secção do PSF e é determinante da resolução de imagem Anatomia do microscópio 

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Tipos de microscopia: 

podem ser sub-divididos consoante o tipo de radiação usado 

microscopia de luz usa luz visível ou fluorescente: 

campo claro 

contraste de fase  

DIC 

epifluorescência 

microscopia eletrónica usa uma fonte de eletrões: 

ME de transmissão 

ME de scanning 

cryo ME 

microscopia confocal usa um laser: 

confocal 

spinning disk 

super-resolução 

Microscopia de campo claro 

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É de todas as microscopias óticas 

a mais simples 

Usa luz transmitida, pou seja, luz 

que é direcionada de baixo para 

cima  

luz passa por um condensador e 

depois incide na amostra 

alguma da luz vai ser absorvida 

pela amostra 

contraste na amostra é causado 

pelo facto de, nas zonas densas 

da amostra, há luz de 

transmissão que é absorvida 

a imagem é formada no plano de 

imagem intermediário 

Microscopia de contraste de fase 

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Usada para produzir imagens 

altamente contrastadas em 

espécimens transparentes 

Foi primeiro descrito em 1934 por 

Frits Zernike 

Consiste na separação da luz de 

fundo da luz difratada devido ao 

espécimen 

o contraste de imagem é 

melhorado de dois modos - a luz 

de fundo tem shift de fase de 

-90º ao passar pela anel de shift 

de fase; posteriormente, o fundo 

é alterado para cinzento 

esta microscopia requer 

condensadores e objetivas 

especiais 

DIC 

Differential interference contrast 

(DIC) ou microscopia de 

Nomarsky 

Modo de funcionamento envolve 

alteração da polarização; a fonte 

luminosa é separada em duas 

partes ortogonais polarizadas 

que são espacialmente 

displaçadas no mesmo plano 

Não implica colorações e as 

células podem estar vivas 

Luz é recombinada antes da 

observação 

Imagem tem a aparência de um 

objeto tri-dimensional devido à 

9. Microscopia 9

diferença de sombras 

Microscopia de fluorescência 

Ao contrário das previamente 

mencionadas,, esta microscopia 

envolve luz refletida e não 

transmitida 

Absorção e radiação de luz 

resulta em fluorescência ou 

fosforescência 

em fluorescência, a absorção 

de luz de excitação e a 

emissão de radiação é 

essencialmente simultânea 

(milissegundos) 

na fosforescência, a emissão 

persiste durante muito mais 

tempo após a extinção de luz 

excitatória 

luz absorvida é sempre mais 

energética do que a emitida  

Uma molécula absorve luz ou 

outra radiação eletromagnética, 

causando a transição a um 

estado energético mais elevado 

→ quando o eletrão transiciona 

para um estado eletrónico mais 

baixo, há emissão de um fotão 

há tb transições não 

radioativas em que não há 

emissão de fluorescência 

normalmente, a luz emitida tem 

um comprimento de onda maior e 

menor energia do que a radiação 

absorvida 

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podemos determinar a absorção 

e a emissão de cada fluorocromo  

esta técnica tira partido da 

autofluorescência de amostras 

ou do uso de moléculas 

fluorescentes denominadas de 

fluorocromos ou fluoroforos 

Limite de difração = 200nm (para 

todas as microscopias de 

fluorescência e luz visível) 

Mesmo abaixo deste limite a 

fluorescência molecular mantém 

se visível 

Vária moléculas podem ser 

usadas simultâneamente 

Problemas comuns na microscopia de fluorescência: 

baixo contraste - fluorescência no background afeta o contraste 

solução - confirmar que os filtros são apropriados para os fluoroforos 

usados; confirmar que o mounting medium usado não tem 

autofluorescência 

photo bleaching - após excitação prolongada, a fluorescência começa a diminuir 

solução - diminuir tempo de exposição ou a intensidade luminosa 

filtros danificados ou incorretos - alterações na fluorescência 

overexposure 

bleed-through - fluorescência de um canal começa a aparecer noutros 

canais 

solução - selecionar fluorocromos que não tem espetros sobrepostos; 

diminuir a intensidade e exposição da luz 

Autofluorescência - algumas amostras apresenta fluorescência sem a 

adição de fluoróforos 

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é importante a escolha do correto método de fixação ou inclusão para o tipo de células específico 

solução - ajustar níveis de exposição; escolha de filtros de emissão e 

excitação; caso não resulte, usar um microscópio confocal 

Microscópio eletrónico de transmissão 

Um microscópio eletrónico usa um feixe de eltrões (beam) para iluminar o espécimen e produzir uma imagem magnificada 

Tem melhor resolução do que os outros microscópios - comprimento de onda dos eletrões é muito inferior ao dos fotões (comprimento de onda mais baixo → menor limite de resolução) 

limite de resolução teórico 5pm 

(o real é de 1nm) 

um canhão de eletrões com um 

filamento de tungsténio emitem 

um feixe de eletrões 

lentes eletroestáticas e 

eletromagnéticas controlam o 

feixe e focam-no para formar a 

imagem 

lentes não são de vidro 

(eletrões não conseguem 

passar) mas sim lentes de 

campo eletromagnético 

coluna inteira de vacuo impede 

deviações do feixe 

ME baseia-se em contrastação 

de imagens e não em corações 

eletrões que atingem uma zona 

eletronicamente densa são 

refletidos ou absorvidos 

Eletrões em camadas não 

eletronicamente densas passam 

pela amostra 

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eletrões que não são desviados 

atingem um sincilador 

fosforescente que lança um flash 

de cada vez que atinge um 

eletrão 

Laser scanning confocal 

permite efetuar secções óticos 

pois adquira imagnes in-focus de 

diferentes planos 

Faz scan da amostra ponto por 

ponto, linha por linha ou múltiplos 

pontos de uma vez e junta tudo 

numa imagem única 

luz em foco é depois retirada 

(???) por um PMT  

photomultiplier detector 

PMT transforma o sinal luminoso 

num sinal elétrico que é integrado 

num computador 

limite de resolução - 200nm 

Vantagens: 

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inúmeras secções de tecidos e células  

seccionamento ótico remove artefactos que possam ter surgido no 

seccionamento mecânico de tecidos 

permite a aquisição multi-dimensional (time-lapses) 

Desvantagens: 

estruturas 3D complexas podem ser difíceis de distinguie  

Número limitado de lasers de excitação (requer um laser para cada canal) 

fototoxicidade em células ou tecidos vivos quando expostos a lasers de intensidade elevada 

custo do sistema é muito elevado 

Spinning disk 

feixe expandido ilumina um 

conjunto de lentes de um disco 

coletos 

cada lente está associada 

lateralmente a um pinhole que 

por sua vez estã associado a 

outro 

quando o disco gira a elevada 

velocidade, os feixes de laser 

fazem um scan por toda a 

amostra 

feixes laser vão excitar 

fluoroforos da amostra 

emissão de fluorescência é mais 

intensa quando o conjunto está 

focado (focal plane) 

aquisição de imagens tem de ser 

sincronizada com a rotação do 

disco de forma a evitar artefactos 

Vantagens: 

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semelhante ao laser mas pode 

ser mais rápido pois usa um 

efeito multiplex (muitos scans de 

uma vez só) 

usa câmaras em vez de PMTs 

como detetores 

câmaras têm uma eficiência 

quantuem (QE - probabilidade de 

converterem um fotão num 

eletrão) de 90%, enquanto que 

as PMTs é de apenas 30-40% 

Desvantagem - semelhante ao 

confocal 

Limite de resolução = 200 nm 

Live cell imaging 

Estudo de células vivas usando um timelapse em microscopia 

Sequência de imagens é retirado e depois observada e acelerada 

Permite-nos seguir eventos sub-celulares a tempo real - migração e divisão celulares 

Podemos observar a cinética de processos dinâmicos - actina 

Podemos detetar eventos muito rápidos ou transientes - ondas de cálcio Eliminamos artefactos provocados pela fixação ou staining 

Requisitos gerais: 

magnificação 

contraste 

resolução 

qualidade da amostra 

rácio sinal-ruído bom 

Requisitos específicos: 

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viabilidade celular 

controlo feito pela atmosfera usada em cultura celular - uso de 

condições esoecíficas e semelhantes ao crescimento biológico 

em mamíferos, temp de 37~ºC e pH 7.4 com 5%CO2 e 

concentração salina e de nutrientes constante 

velocidade de aquisição 

campo ótico 

múltiplos canais (fluorescência ou transmissão) 

Microscopia de super resolução 

do mesmo estilo que a microscopia de fluorescência confocal 

super resolução funcional inclui métodos determinísticos e estocásticos 

Métodos determinísticos - tiram partido do facto de fluoroforos 

apresentarem uma resposta não linear a excitação (STED ou RESOLFT) 

Métodos estocásticos - tiram partido da ativação temporal de 

fluoroforos para os separar espacialmente (STORM ou PALM) 

STED 

Stimulated Emission Depletion - 

usa um par de lasers 

sincronizados 

excitação de um fluoróforo 

ocorre no plano confocal do 

primeiro laser (a vermelho - não 

sei se é sempre a vermelho) 

os dois lasers atingem o alvo 

quase simultâneamente e o 

computador queima o resultado 

do segundo, limitando a imagem 

obtida 

limite de resolução passa de 

200nm para 50nm 

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Deconvulução de imagem 

Deconvulução - processo de 

remoção de distorção ótica que 

ocorre quando as imagens são 

adquiridas 

Deconvulução é feita normalmente 

por algoritmos incluídos em 

softwares - tratamento e 

manipulação de imagem 

Importante em stacks 3D de imagens 

em microscopia de fluorescência 

convencional 

Análise de dados 

Envolve a extração de informação de imagens ou filmes de microscopia Fiji e ImageJ são alguns exemplos 

Permite a contabilização em número, tamanho e intensidade de objetos Permite tb o processamento e análise de time lapses - velocidade e distância 

Tracking de objetos de forma automática ou manual num time lapse tb é possível 

Citometria de fluxo 

Técnica baseada em lasers que permite uma análise rápida da superfície celular e componentes intracelulares 

Suspensão celular foca-se no uso de hidrodinâmicas →permite que apenas uma célula passe pelo detetor laser 

Luz emitida ou refratada das células é detetada quando elas passam pelo laser 

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