Notas sobre Sistemas de Secreção Bacteriana

Estrutura e Função de Proteínas

Sistemas de Secreção Bacteriana

Introdução

As bactérias desenvolveram várias rotas para o transporte de substratos através do envelope celular.
Esses sistemas são complexos multiproteicos que funcionam como nanomáquinas para trocas reguladas com o meio extracelular.
Os substratos secretados desempenham funções como aquisição de nutrientes, motilidade e comunicação intercelular.
Patógenos secretam toxinas nocivas, adesinas e enzimas degradativas, que auxiliam na colonização de organismos hospedeiros.
Tem de haver proteinas da membrana interna e externa

Classificação dos Sistemas de Secreção

Os sistemas de secreção são classificados com base em seu mecanismo, composição e relação evolutiva.
Em bactérias Gram-negativas, a secreção envolve a translocação através das membranas interna e externa. Existem pelo menos 6 classes gerais de sistemas de secreção de proteínas: Tipo I a VI.
Bactérias Gram-positivas compartilham alguns sistemas de secreção com bactérias Gram-negativas e também exibem um sistema específico, o tipo VII.

Secreção através da Membrana Interna

A primeira barreira que qualquer proteína encontrará ao tentar sair de uma célula bacteriana é a membrana interna.

Três sistemas principais estão envolvidos no transporte de proteínas através da membrana interna:
1. Caminho SEC (Secreção Geral ou GSP) (translocão SecYEG)
2. Caminho de Reconhecimento de Sinal (SRP) (translocão SecYEG)
3. Caminho TAT (Translocação de Arginina Dupla) (translocão TAT)
SEC, SRP e Tat são universais para eubacteria, archaea e eukariontes.

SEC pathway

Reconhece uma sequência líder hidrofóbica N-terminal de proteínas destinadas à secreção.
Proteínas são translocadas unfolded, usando a hidrólise de ATP e um gradiente de protões como fonte de energia.
A translocase consiste de um heterotrímero embutido na membrana: SecY/SecE/SecG (sec61α, sec61β e sec61γ nos eucariotos).
O subunidade SecA no citoplasma hidrolisa ATP para impulsionar a translocação.

Proteinas podem ser alvo do sec por duas rotas:

Co-tradução: A sequência de sinal é ligada pela partícula de reconhecimento de sinal, que direciona o ribossoma para a translocase via recetor FtsY - SRP
Pós-tradudução: Após a tradução, a chaperona SecB direciona a proteína para a translocase, ligando-a a SecA - SEC

SEC

Tradução da Proteína

A proteína é inicialmente traduzida no citoplasma da célula.

Captura pelo SecB

A proteina unfolded por uma proteína auxiliar chamada SecB. O SecB liga-se à proteína, mantendo-a num estado unfolded, facilitando assim a sua secreção através da membrana celular.

SecA e SecYEG

Depois de o SecB entregar a proteína não dobrada ao SecA, este último associa-se à estrutura que atravessa a membrana, chamada SecYEG, que funciona como um translocão O SecA, que é uma ATPase, desempenha um papel dinâmico neste processo:

O SecA liga-se ao ATP, permitindo-lhe inserir-se profundamente no canal SecYEG.
Empurra cerca de 20 aminoácidos da proteína exportada para dentro do canal.
A hidrólise do ATP provoca a libertação da proteína por parte do SecA, que depois se retrai.

Este processo pode ser repetido, uma vez que o SecA pode ligar-se a uma nova molécula de ATP e voltar a ligar-se à proteína alvo, reinserindo-a e empurrando outra porção de 20 aminoácidos através do canal.

Pathway Tat

Reconhece um motivo rico em resíduos de aminoácidos básicos na região N-terminal de proteinas com cofatores (S-R-R-x-F-L-K)
Transloca as proteínas em estado folded, usando apenas um gradiente de protões como fonte de energia - independente de ATP
Em Escherichia coli, o translocão Tat consiste em três proteínas de membrana: TatA, TatB e TatC
- TatC reconhece as proteínas-alvo
- TatA forma o poro

Secreção através da Membrana Externa

O sistema de secreção pela membrana externa é realizado só por bactérias Gram-negativas, podendo ocorrer através de:
- Processo de dois passos: (tipo II, tipo V ou raramente tipos I ou IV) utilizando métodos anteriores para exportar a proteína através da membrana interna primeiro.
- Processo de um passo: A proteína é exportada diretamente do citosol para fora da célula sem etapas intermediárias (tipos I, III, IV ou VI).

Tipo I Secreção (T1SS)

Sistema de secreção que permite o movimento de proteínas do citoplasma para fora da célula em um único passo de energia, através de um complexo exportador que atravessa as membranas interna e externa.
O complexo exportador é formado por três subunidades de proteína:
- Transportador ABC (ATP - Binding Cassette)
- Proteína de fusão da membrana - MFP
- Proteína formadora de poro da membrana externa - OMP.

Exemplo: Hemoalísina A (HlyA)

Subunidades do T1SS:
- HlyB (transportador ABC)
- HlyD (proteína de fusão)
- TolC (OMP).

HlyB (ABC)

HlyB é composto por 2 domínios transmembranares e 2 domínios de ligação de nucleotídeos. O gene desde só traduz para 1 domínio TMD e 1 NDB, por isso é sugerido que funciona como um homodimero para produzir um poro funcional
No dominio N terminal encontram-se membros da peptidase 39, no entanto a cisteina catalitica está em falta, formando um apendix enzimático inativo.
As proteinas ABC têm também o papel de dar especificidade à maquinaria de secreção. Em adição à sequencia de secreção, T1SS contem um domínio caracterizado por nonapeptidos com repetições de glicina e resíduos de aspartato

HlyD (MFP)

Localizada na membrana interna
Não há informação estrutural
Analises topologicas indicam. Um pequeno N-terminal citoplasmático, uma helice alfa membranar seguida por uma parte beta longa terminal.
Aparece em forma de trimeros ou hexameros.

TolC (OMP)

Forma homotrímeros num canal de 140 A
Na membrana externa é composto por barries Beta e no periplama por alfa-helices
O diametro de abertura pode ser alterado num rearranjo das alfa-helices

Montagem do T1SS

Os MFPs interagem em uma forma trimerizada com as proteínas ABC, criando um canal periplasmático.
A ligação dos substratos leva a alterações conformacionais nos MFPs que por sua vez interagem com o OMP para completar o canal para o meio externo.
A T1SS é capaz de exportar uma vasta gama de proteínas, incluindo enzimas, toxinas e adesinas.

Tipo II Secreção (T2SS)

O T2SS é consideravelmente mais complexo do que os sistemas T1SS, mesmo tendo como função principal o transporte de proteínas através da membrana externa.
Caminho Sec: Para atravessar a membrana interna, é necessário um sistema de secreção separado, normalmente o caminho SEC ou o sistema Tat.
Capacidade do T2SS: Promove a secreção de proteínas grandes e multiméricas que são folded no periplasma.

O T2SS demonstra uma relação evolutiva com a maquinaria de montagem do pilus do tipo IV. Ambas as maquinarias compartilham componentes nucleares comuns:

GspD: Secretina da membrana externa
GspE: ATPase citoplasmática
GspF: Proteína transmembranar interna
Pseudopilinas: maior GspG, e menor H, I, J, K)
GspA: Peptidase de pre-pseudopilina/pilin/methyltransferase

Estrutura do T2SS

O T2SS utiliza entre 12 e 16 proteínas para realizar a secreção pela membrana externa, mas apenas 2 estão localizadas na membrana externa.

GspE: Interage com ATP como uma ATPase (energia) para a exportação das proteínas.

GspL e GspM: Proteínas na IM que ancoram a ATPase ao aparelho de secreção.

Pseudopilinas: Formam uma estrutura multimérica chamada pseudopilus.

O complexo da membrana externa do T2SS consiste em:

GspD: Proteína que forma o poro na membrana externa (multímero de 12-14 cópias).

GspS: Lipoproteína que auxilia na localização do multímero GspD na membrana externa.

A hipótese sugere que o pilus pode crescer para empurrar as moléculas secretadas através do complexo da membrana externa ou funcionar como uma rolha para fechar o canal quando não é necessário.

Poro e Sinalização de Secreção

O poro formado pelo GspD possui aproximadamente 55Å de diâmetro, tamanho suficiente para proteínas passarem em estado folded.

A natureza do sinal de secreção é elusivo

Características dos Substratos: Os substratos do T2SS são, em geral, grandes proteínas ricas em motivos beta-strand e motivos loop, sem características comuns de sequência ou estrutura.

Tipo III Secreção (T3SS)

Segregação do T3SS

O T3SS é considerado o mais complexo de todos os sistemas de secreção descritos até agora, também conhecido como injectissoma.

Translocação de Proteínas: Utiliza um apêndice semelhante a uma agulha para a translocação de proteínas efetoras do citoplasma bacteriano para o citoplasma de outras células.
Interações com Hospedeiros: Encontrado em bactérias Gram-negativas que interagem com hospedeiros vegetais e animais, seja como patógenos ou mutualistas.
Modelação por efetores transportados: Efetores modulam uma variedade de funções celulares do hospedeiro, incluindo respostas imunes e de defesa, promovendo a sobrevivência e colonização bacteriana.
Evolução em comum com o flagelo

Origem Evolutiva e Genes

Os genes do T3SS podem ser codificados em ilhas de patogenicidade de fontes externas, (transferência de genes horizontal)

Existem pelo menos sete famílias de injectissomas; algumas bactérias podem conter mais de um T3SS (exemplo: Salmonella typhimurium possui duas ilhas de patogenicidade que codificam diferentes T3SS).

Até 25 proteínas podem ser necessárias para o montar, mas apenas 9 são conservadas em todas as 7 famílias, 8 das quais também são conservadas no aparato flagelar.

Estruturas do Injetossoma

São compostos por

Série de anéis basais que atravessam as membranas interna e externa da bactéria, conectados a uma agulha oca (em Yersinia), filamento (em Salmonella) ou pilus (em P. syringae).
Cada estrutura é equipada com um poro de translocação que é inserido na membrana plasmática da célula alvo.
ATPase Conservada: Uma ATPase conservada associa-se à base citoplasmática da injetossoma e energiza o transporte.
Classes de Chaperones: Duas classes de chaperonas ajudam na montagem, enquanto uma terceira classe auxilia na translocação das proteínas efetoras.

Estrutura Basal

A estrutura basal ancora a agulha nas membranas bacterianas, atravessando a membrana interna, o periplasma e a membrana externa.

Dimensões: Base mede aproximadamente 250 Å x 300 Å.

Em Salmonella, a estrutura do anel da MI é formada por PrgH e PrgK, que se montam em dois anéis concêntricos. O anel externo da MI consiste em 24 monômeros de PrgH.

O anel da OM é formado pela secretina da família de proteínas integrais de membrana, como observado em Salmonella InvG (15 monômeros), Yersinia YscC, Shigella MxiD e EPEC EscC.

Os anéis da MI e OM cercam uma estrutura tubular interna formada por PrgJ7 em Salmonella, MxiI12 em Shigella e YscI13 em Yersinia.

A secreção através da base é controlada por um aparato de exportação que serve como uma plataforma para a montagem da estrutura basal e controla a especificidade do substrato.

O aparato de exportação é um complexo de proteínas de membrana integral altamente conservadas:

SpaP
SpaQ
SpaR
SpaS
InvA (em Salmonella)

Um complexo ATPase associado à membrana interna bacteriana é responsável por energizar a exportação de substratos através do aparato de agulha.

→ A hidrólise do ATP está acoplada ao unfolding e libertação de proteínas efetoras dos chaperones antes da secreção.

O principal componente do complexo ATPase é um homohexâmero formado pela família de proteínas EscN (InvC em Salmonella).

Estrutura da Agulha

A agulha monta-se a partir de múltiplas cópias de uma única proteína, o protomero da agulha, que é uma proteína polar com menos de 90 aminoácidos.

Estrutura dos Protomeros

As formas monoméricas dos protômeros da agulha adotam estruturas hairpin em α-hélice (duas α-hélices unidas por um motivo PXXP de quatro resíduos).

Modelagem da agulha de Salmonella revelou uma estrutura de 500 Å de comprimento e 70 Å de largura, envolvendo um canal interno com um diâmetro de aproximadamente 25 Å.

Ponta da Agulha

Na extremidade distal da agulha, está um complexo de proteínas que:

Sente a presença de células eucarióticas (liga-se a sinais extracelulares da célula hospedeira, como sais biliares no intestino).
Serve como uma plataforma para a montagem do translocão, que é essencial para a invasão bacteriana
Regula a secreção de proteínas efetoras na célula hospedeira.

Possuem na N-terminal uma α-hélice em hairpin, um longo coiled-coil central e uma região C-terminal de α-hélices e β-stands.

Translocão

A etapa final na montagem do aparato de agulha é a formação do translocão, que forma um poro de 20 a 30 Å na membrana da célula hospedeira para permitir a passagem de efetores.

O translocão é formado por duas proteínas de membrana integral chamadas SipB e SipC em Salmonella.

SipB é uma proteína α-helicoidal de 62 kDa que pode se ligar a membranas celulares.

A região N-terminal de SipB possui um domínio de coiled-coil trimérico formado por três α-hélices antiparalelas, responsável por sua auto-oligomerização.

Tipos de Secreção de tipo III

Os sistemas de secreção do Tipo III desempenham dois papéis significativamente diferentes nas bactérias:

Servem como um sistema de montagem e exportação na produção do flagelo bacteriano (F-T3SS).
Translocam proteínas efetoras nas células de plantas e animais.

As proteínas efetoras que serão secretadas pela agulha possuem um sinal de secreção - uma sequência curta de aminoácidos localizada no N-terminal que o complexo da agulha consegue reconhecer.

Ao contrário de outros sistemas de secreção, o sinal de secreção das proteínas T3SS nunca é clivado da proteína.

Tipo IV Secreção (T4SS)

O sistema de secreção do Tipo IV (T4SS) é único em sua capacidade de transportar ácidos nucleicos além de proteínas para dentro de células de plantas e animais, bem como em leveduras e outras bactérias.

O complexo T4SS pode atravessar ambas as membranas de uma bactéria Gram-negativa ou a membrana e a parede celular de uma bactéria Gram-positiva.

O sistema consiste em pelo menos 12 proteínas, nomeadas VirB1-11 e VirD4.

A maquinaria do T4SS é alimentado por três ATPases: VirB4, VirB11 e VirD4.

Os componentes principais incluem VirB6-10 e um apêndice extracelular ou pilus, que consiste no componente maior VirB2 e no componente menor VirB5, que parecem estar ligados à maquinária central através de VirB7.

VirB1 é responsável pela remodelação do peptidoglicano através de sua atividade lítica de transglicosilação.

Secreção no T4SS

Têm capacidade de translocar proteínas tanto de maneira unidirecional quanto bidirecional.

Existem evidências de que o T4SS (Ptl de Bordetella pertussis) e, possivelmente, o sistema VirB de Brucella spp. recrutam substratos do periplasma. Nesta forma, os substratos são translocados primeiro através da membrana interna para o periplasma (SEC) e, em seguida, interage com o complexo da membrana externa para segregação através da membrana externa.

As proteínas efetoras do T4SS geralmente possuem um sinal de translocação localizado nos terminais C e consistem em clusters de resíduos de Arg positivamente carregados (para substratos VirB/VirD4 de A. tumefaciens) ou resíduos hidrofóbicos (para substratos Dot/Icm de L. pneumophila).

Além dos sinais de translocação C-terminais, há também evidências crescentes da importância de outros motivos para anexação a "proteínas de acoplamento do T4". Esses sinais estão localizados terminalmente ou dentro da proteína.

Tipo V Secreção (T5SS)

O sistema de secreção de dois passos depende do caminho SEC para a translocação pela membrana interna.

Categorias de T5SS

Os sistemas de secreção do Tipo V (T5SS) podem ser agrupados em três categorias principais:

Tipo Va – os autotransportadores

Tipo Vb – o sistema de dois parceiros

Tipo Vc – o sistema oligomérico de coiled-coil (Oca), também conhecido como sistema AT-2.

Processo de Exportação T5SS

É o processo mais simples para a exportação de adesinas, enzimas, toxinas e outros fatores de virulência.

Os membros do T5SS contêm:

um sinal N-terminal mediando o transporte dependente do Sec através da membrana interna,

um domínio passageiro que exerce atividade biológica no espaço extracelular,
um domínio β, que forma um β-barrel com um poro hidrofílico na membrana externa,
um conector que liga o domínio passageiro e o domínio β.

Subgrupo Va - autotransportadores “clássicos”

Os autotransportadores “clássicos” incluem os autotransportadores monoméricos que contêm todas as informações necessárias para translocação através de ambas as membranas em uma única cadeia polipeptídica.

Subgrupo Vb: Sistema de Dois Parceiros (TPS)

A estrutura é composta por dois componentes principais: o domínio passageiro (TpsA) e o transportador (TpsB).
O transportador TpsB é responsável por reconhecer o TpsA, possuindo duas domínios polipeptídicas associadas ao transporte (POTRA) que facilitam essa interação.

Subgrupo Vc: Sistema Oligomérico em Coiled-Coil (Oca)

Neste sistema, são formados transportadores autoportantes trimericos, que contêm três subunidades idênticas.
Cada subunidade contribui com quatro β-stands, resultando em um total de doze β-barrel, permitindo a projeção de três domínios passageiros no espaço extracelular.

Tratamentos Pós-Translocacionais

Após a translocação, o domínio passageiro pode sofrer um dos seguintes tratamentos:

Permanecer covalentemente ligado à unidade de transporte.
Ser clivado, mas permanecer anexado à superfície celular.
Ser liberado no espaço extracelular após clivagem.

Tipo VI Secreção (T6SS)

Um sistema de secreção de um passo que pode introduzir proteínas efetoras diretamente no citoplasma de células hospedeiras, análogo às maquinarias T3SS e T4SS.

As sequências gênicas que codificam a T6SS compartilham homologia com genes de bacteriofagos, e a estrutura predita assemelha-se a uma maquinário de injeção de bacteriofago T4 invertido.

Componentes e Funções

O modelo do injectosoma T6SS é proposto incluir:

Um chaperone citoplasmática com atividade ATPase, chamada clpV.

Um canal que conecta a membrana interna à membrana externa.

Uma agulha com uma proteína formadora de poros em sua extremidade.

Alguns componentes da maquinaria também podem atuar como efetores, sendo translocados para as células hospedeiras (ex: VgrG-1 do Vibrio cholerae que contém um domínio C-terminal capaz de entrar em macrófagos - crosslink da actina).

As identidades e funções dos efetores da T6SS ainda são pouco compreendidas.

Tipo VII Secreção (T7SS)

Este sistema de secreção é exclusivo para bactérias gram-positivas.
Algumas espécies, como as micobactérias, têm uma parede celular modificada por lipídios, conhecida como micobranha.
Como resultado o genoma destas especies contenham um sistema de secreção especializado - tipo VII

Essencial para a virulência de micobactérias como Mycobacterium tuberculosis.
O sistema é codificado por um lócus ausente em cepas atenuadas de Mycobacterium bovis (BCG), que são utilizadas na vacinação contra tuberculose.
Clusters de genes T7SS têm sido identificados em várias bactérias gram-positivas, como Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis.

Estrutura e Funcionalidade

O canal central é composto pelas proteínas de membrana EccB, EccC, EccD e EccE, sendo que EccD é previsto como a estrutura central no ciclo celular.
A EccC possui um domínio ATPase e provavelmente funciona como componente de acoplamento.
No citoplasma, duas proteínas facilitam a secreção:
- EccA, uma ATPase da família AAA+.
- EspG, que se liga ao substrato e provavelmente atua como uma chaperona para direcionar o substrato à maquinaria de secreção.
O mecanismo geral de translocação através da membrana externa da micobactéria ainda não foi identificado, deixando os detalhes da translocação em aberto.