RNA的轉錄後修飾

RNA的轉錄後修飾 (Post-transkriptionale Modifikationen)

C. 轉錄後修飾概述

  • 轉錄後修飾 (Post-transkriptionale Modifikationen) 是指RNA從初級轉錄本成熟的過程，涉及以下主要步驟：

    • 剪接 (Spleißen)：移除非編碼中間序列（內含子 Introns）。

    • 5'-端加帽 (5'-Cap)：在RNA的5'端添加一個特殊的修飾核苷酸。

    • 聚腺苷酸尾 (Poly-A-Schwanz)：在RNA的3'端添加一串腺苷酸。

RNA分子成熟過程

  • DNA →\to 轉錄 (Transkription) →\to 未成熟RNA (unreife RNA)

  • 未成熟RNA →\to 轉錄後加工 (Posttranskriptionale Prozessierung) →\to 成熟RNA (reife RNA)

  • 成熟RNA（包括mRNA、tRNA、rRNA等）

    • mRNA →\to 轉譯 (Translation) →\to 蛋白質 (Protein)

    • 蛋白質 →\to 轉譯後加工 (Posttranslationale Prozessierung) →\to 最終蛋白質 (fertiges Protein)

真核生物mRNA的成熟特性

  • 異源核RNA (Heterogene nukleäre RNA, Primärtranskript) 是初級轉錄本，經過修飾後成為 成熟細胞質RNA (Reife cytoplasmatische RNA)。

  • 其主要成熟特徵包括：

    • 單基因 (Monogen)：通常每個基因編碼一個蛋白質。

    • 聚腺苷酸尾 (Poly-(A)-Schwanz)

    • 5'-帽 (5'-Kappe)

    • 剪接 (Spleißen)

基因結構：外顯子和內含子 (真核生物)

  • 基因組DNA組成：

    • 起始密碼子 (Startcodon)：AUG (也編碼甲硫氨酸)。

    • 終止密碼子 (Stoppcodon)：UAA, UAG, UGA。

    • 開放閱讀框 (offener Leserahmen)：介於起始和終止密碼子之間，編碼蛋白質。

    • 5'或3'非翻譯區 (UTR)：不編碼蛋白質的區域。

    • 外顯子 (Exon)：含有蛋白質編碼信息的區域。

    • 內含子 (Intron)：非編碼區域，位於外顯子之間。

  • 示意圖：5′UTR→Exon1→Intron→Exon2→Intron→Exon3→3′UTR5'UTR \to Exon1 \to Intron \to Exon2 \to Intron \to Exon3 \to 3'UTR，其中 AUG 在起始端，UAA 在終止端。

外顯子和內含子範例：卵白蛋白 (Ovalbumin)

  • 卵白蛋白基因的mRNA顯示，成熟RNA與其互補DNA（cDNA）對應，明確了外顯子為編碼區，內含子則在轉錄後被移除。

外顯子和內含子範例：雌激素受體α (Östradiolrezeptor alpha, ESR1)

  • 雌激素受體α基因的DNA約為 250,000250,000 bp (鹼基對)。

  • 該基因產生含有 88 個外顯子的RNA。

  • 成熟的RNA長度為 6,6006,600 個鹼基。

  • 編碼區 (CDS) 長度為 1,6441,644 個鹼基。

  • 最終編碼的蛋白質含有 548548 個胺基酸。

RNA剪接：兩種酯交換反應 (Umesterungsreaktionen)

  • 剪接是一個能量中性的過程，伴隨兩次酯交換反應。

  • 原理：核苷酸中的羥基作為親核基團攻擊磷酸二酯鍵。

  • 自由能變化：ΔG′0=0 kJ/mol{\Delta}G'0 = 0 \text{ kJ/mol}，表示該反應在熱力學上是能量中性的。

  • 反應步驟：涉及外顯子1、內含子、外顯子2之間的親核攻擊。

第一組自剪接內含子 (Gruppe I: Spleißen mit Ribozym)

  • 這類內含子具有自我剪接能力，不依賴蛋白質酵素。

  • 機制：首先，一個游離的鳥苷輔因子（G）的3'-OH基團攻擊5'接合點，斷裂磷酸二酯鍵並與5'內含子端連接。然後，外顯子1的3'-OH基團攻擊3'接合點，將兩個外顯子連接起來，同時釋放呈線性結構的內含子。

第二組自剪接內含子 (Gruppe II: Spleißen mit Ribozym)

  • 這類內含子也具有自我剪接能力，形成套索結構 (Lariat-Struktur)。

  • 機制：內含子中一個特定腺苷核苷酸的2'-OH基團作為親核基團，攻擊5'剪接位點。這導致5'剪接位點斷裂並形成一個套索狀的內含子中間體。隨後，外顯子1的3'-OH基團攻擊3'剪接位點，連接兩個外顯子並釋放套索狀內含子。

剪接體剪接 (Gruppe III: Spleißen mit Spleißosom)

  • 這是真核生物中mRNA剪接的主要方式，由一個複雜的核糖核蛋白複合物——剪接體 (Spleißosom) 執行。

  • 組件：剪接體由多種小核RNA (snRNA, small nuclear RNAs) 和蛋白質組成，形成小核核糖核蛋白 (snRNPs, "snurps")。

    • snRNA通常長度約 100−200100-200 個核苷酸。

  • 剪接過程：

    1. 不活躍剪接體形成：U1 snRNP識別5'剪接位點，同時其他因子（如BBP）識別3'剪接位點和分支點的腺苷核苷酸。

    2. 剪接體活化：U2 snRNP結合到分支點，U4/U6和U5 snRNP複合物加入。經過ATP能量水解 (ATP →\to ADP + P$_i$)，剪接體構象重排，U1和U4被釋放。

    3. 套索結構形成：活化的剪接體促使內含子中的分支點腺苷的2'-OH攻擊5'剪接位點，形成套索 (Lariat) 結構。

    4. 外顯子連接：外顯子1的3'-OH攻擊3'剪接位點，連接兩個外顯子，並釋放出套索狀的內含子和其餘的snRNPs。

可變剪接 (Alternatives Spleißen)

  • 定義：同一段DNA（基因）可以通過可變剪接產生多種不同的mRNA異構體，進而編碼多種不同的蛋白質。

  • 機制：通過選擇性地包含或排除特定的外顯子，或使用不同的剪接位點來產生多種mRNA。

  • 示意圖：一個基因含有外顯子1、2、3、4、5。經過可變剪接，mRNA可能包含外顯子1+2+3，或者1+2+4+5，或者1+2+3+5，從而翻譯成蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C等具有不同功能的變體。

  • 範例：血管內皮生長因子 (Vaskulärer Endothel-Zell Wachstumsfaktor, VEGF)。

    • VEGF參與血管生成 (Angiogenese) 和腫瘤生長 (Tumorwachstum)。

    • 不同的剪接形式導致產生具有不同功能的VEGF蛋白質變體。

5'-端加帽 (7-甲基鳥苷殘基，7-Methylguanosinrest)

  • 位置：真核生物mRNA的5'末端。

  • 功能：

    • 保護mRNA免受核酸酶降解 (Schutz vor Abbau)。

    • 啟動翻譯 (Initiation der Translation) – 促進mRNA與核糖體結合。

  • 反應機制：

    1. 移除γ-磷酸：磷酸水解酶 (Phosphohydrolase) 從mRNA的5'末端移除一個γ-磷酸集團，留下一個二磷酸的5'末端 (ppNp)。

    2. 添加鳥苷酸：鳥苷轉移酶 (Guanyl-Transferase) 利用GTP的鳥苷酸部分，以一個不尋常的 5′→5′5'\to 5' 三磷酸鍵 (5',5'-Triphoshatbindung) 將鳥苷酸添加到mRNA的5'二磷酸末端，釋放焦磷酸 (PPi)，形成GpppNp。

    3. 7-甲基化：鳥嘌呤-7-甲基轉移酶 (Guanin-7-Methyltransferase) 利用S-腺苷甲硫氨酸 (adoMet) 作為甲基供體，將7-位甲基化到鳥苷酸上，形成m7GpppNp。

    4. 2'-O-甲基化（可選）：有時2'-O-甲基轉移酶 (2'-O-Methyltransferase) 會進一步甲基化第一個或第二個轉錄核苷酸的2'-OH基團。

聚腺苷酸尾 (Poly-(A)-Schwanz)

  • 位置：真核生物mRNA的3'末端。

  • 形成機制：

    1. 識別信號：在預期的聚腺苷酸位點上游約 10−3010-30 個核苷酸處，存在一個普遍保守的識別序列 AAUAAA（聚腺苷酸信號）。

    2. 切割：在AAUAAA信號序列下游的一個特定位點，內切核酸酶 (Endonuclease) 切割初級轉錄本。

    3. 加尾：聚腺苷酸聚合酶 (Poly-Adenylat-Polymerase) 在不需模板的情況下，將約 100−250100-250 個腺苷酸殘基添加到切割後的3'末端，形成聚A尾。

  • 功能：

    • 增強mRNA的穩定性 (Stabilität)。

    • 促進mRNA從細胞核輸出到細胞質。

    • 參與翻譯起始 (Initiation der Translation)。

轉錄後成熟總覽：卵白蛋白基因範例

  • DNA：卵白蛋白基因約 7,7007,700 bp (鹼基對)。

  • 轉錄和5'-蓋添加：產生含有 77 個內含子的初級轉錄本 (Primärtranskript)。這個初級轉錄本已經在 5′5' 端添加了Cap。

  • 剪接、切割和聚腺苷酸化：通過剪接移除內含子，並在 3′3' 端添加聚A尾。

  • 成熟mRNA：最終形成長度約 1,8721,872 個核苷酸的成熟mRNA。

核糖體RNA (rRNA) 的剪接

  • 轉錄：RNA聚合酶I (RNA-Polymerase I) 轉錄一個 45S45S 的前體rRNA轉錄本 (Prä-rRNA-Transkript)（在真核生物中）。

  • 修飾：這個前體轉錄本在核糖的2'-羥基上進行甲基化 (Methylierung an 2'-Hydroxylgruppe der Ribose)。

  • 切割：通過多個切割事件，將 45S45S 前體加工成成熟的rRNA分子：18S18S, 5.8S5.8S, 28S28S rRNA。

轉運RNA (tRNA) 的成熟

  • tRNA的初級轉錄本需要經過複雜的加工過程才能成為成熟的tRNA。

  • 主要步驟：

    1. 5'-端切割：由核糖核酸酶P (RNase P, 一種核酶 Ribozym) 進行，移除 5′5' 端多餘的序列。

    2. 3'-端切割：由核糖核酸酶D (RNase D) 進行，移除 3′3' 端多餘的序列。

    3. CCA序列添加：tRNA核苷酸轉移酶 (tRNA-Nucleotidyltransferase) 在不需模板的情況下，在 3′3' 端添加保守的CCA序列（接受胺基酸的位點）。

    4. 剪接 (Spleißen)：如果初級轉錄本含有內含子（較少見），則這些內含子也會被剪接掉。

    5. 鹼基修飾 (Modifikation von Basen)：大量的內部鹼基被修飾，形成多種稀有鹼基（如假尿苷、二氫尿苷、甲基鳥苷等）。

  • 這些修飾對於tRNA的正確摺疊、穩定性以及與胺基酸和密碼子的特異性識別至關重要。

RNA的降解 (Abbau der RNA)

  • RNA半衰期 (Halbwertszeit)：

    • 細菌中約 1−21-2 分鐘。

    • 真核生物中約 33 小時。

  • 降解酶：由核糖核酸酶 (Ribonucleasen, RNasen) 執行，這些酶可以從 5′→3′5'\to 3' 方向或 3′→5′3'\to 5' 方向降解RNA。

  • 細菌中降解：通常在核糖體進行翻譯的同時或之後發生，降解速度快。

  • 真核生物中降解：

    • mRNA的聚腺苷酸尾 (Poly-(A)-Schwanz) 提供了穩定性。

    • 降解過程：

      1. 首先，聚A尾被逐漸縮短 (verkürzt)。

      2. 隨後，5'-帽結構從5'末端被移除 (entfernt)。

      3. RNA從5'到3'末端被降解 (abgebaut)。