1. Histologická technika

Definícia a účel histologickej techniky

• Histologická technika (HT) sa zaoberá spôsobmi prípravy tkanív a orgánov na histologické vyšetrenie (metódy, ktorými pripravujeme histologické preparáty).

• Účel prípravy histologických preparátov:

  • Pedagogický: porozumieť štruktúre tkanív a orgánov, porozumieť vzťahu medzi štruktúrou a funkciou tkanív a orgánov, vytvoriť základy pre štúdium histopatológie.

  • Diagnostický: poskytnúť základňu pre spracovanie poškodených a chorobne zmenených tkanív a orgánov.

  • Experimentálny: vedecký – výskum.

Základné podmienky pre prípravu histologického preparátu

• Vrstva tkaniva musí byť tenká až priesvitná.

• Preparát musí byť kontrastný, aby bolo možné odlíšiť jednotlivé štruktúry tkaniva.

• Jednotlivé zložky tkaniva nesmú byť pozmenené posmrtným rozkladom ani nešetrnými zásahmi pri odbere alebo ďalšom spracovaní.

Schéma spracovania histologického materiálu (pre svetelnú mikroskopiu)

• (1) Odber histologického materiálu.

• (2) Fixácia: A – mäkké tkanivá; B – tvrdé tkanivá.

• (3) Dekalcifikácia (iba pri tvrdých tkanivách).

• (3) Vypieranie (pranie) – dôkladné odstránenie zvyškov suroviny.

• (4) Odvodnenie – dehydratrácia (postupné zvyšovanie koncentrácie alkoholu).

• (5) Prejasnenie (clearing).

• (6) Presycovanie – zalievanie (infiltrácia).

• (7) Vlastné zalievanie – infiltrácia zalievacím médiom (parafín, paraplast, celoidín).

• (8) Rezanie – vytváranie tenkých rezov mikrotómom.

• (9) Lepenie rezov – lepenie na sklíčko.

• (10) Odstránenie zalievacieho média – odparafinovanie (xylénom, alkoholom).

• (11) Zavodnenie – návrat do vodného prostredia.

• (12) Farbenie – histologické farbenie.

• (13) Odvodnenie – dehydrátory.

• (14) Prejasnenie – čistenie a príprava na montáž.

• (15) Montovanie – uzatváranie rezov a vytvorenie trvalého preparátu.

• Trvalý histologický preparát.

Odběr vzoriek tkaniva

• Biopsia → bioptické vyšetrenie.

• Nekropsia → nekroptické vyšetrenie (post mortem).

• Odborom (excidziou) získame požadovaný malý kúsok tkaniva: približne $1 imes 1 imes 0{,}5 ext{ cm}$ (excízia, protózna excízia).

• Kyretáž – získavanie povrchových buniek dutých orgánov.

• Punkcia – odobratie kúska tkaniva pomocou hrubej injekčnej ihly.

Kritériá pre správny ober histologického materiálu (pre bioptické vyšetrenie)

• Čas odboru → čo najkratší.

• Veľkosť fixovanej vzorky: hrúbka < $0{,}5 ext{ cm}$; budúca rezná plocha nemá presahovať $1{-}2 ext{ cm}^2$.

• Množstvo fixačnej tekutiny → $20{-}40 imes ext{objem vzorky}$.

• Uloženie vzorky.

• Celková manipulácia → šetrná.

• Nadbytok krvi.

• Správne označenie – presné, zreteľné a priamo na nádobe: meno, priezvisko, rok narodenia, druh tkaniva alebo orgánu, dátum odberu, názov oddelenia a meno lekára.

Fixácia

• Definícia: fixácia je rýchle, šetrné konzervovanie tkaniva a umožňuje koaguláciu proteínov.

• Cieľ fixácie: predchádzanie posmrtným zmenám (autolýze) pôsobením enzýmov alebo baktérií.

• Princíp: fyzikálno-chemické denaturácie natívnych bielkovín.

• Základné požiadavky na kvalitné fixatívum:

  • A) Maximálne zachovanie pôvodnej štruktúry tkaniva.

  • B) Zachovanie dobrej farbiteľnosti tkaniva.

  • C) Rýchla capable penetrácie do tkaniva.

• Spôsoby fixácie:

  • 1) Fyzikálna fixácia – teplota (freezing drying), vákuum, žiarenie.

  • 2) Chemická fixácia – najčastejší spôsob, chemické fixačné látky.

Spôsoby fixácie a klasifikácia chemických fixačných prostriedkov

• Spôsoby prevedenia fixácie:

  • A) Implant fixácia – ponorením vzorky do fixačného roztoku (immersion).

  • B) Perfúzna fixácia – nastrieknutím cievneho riečišťa, ktorý zásobuje požadovanú časť tkaniva/orgánu (perfúzia).

• Klasifikácia chemických fixačných prostriedkov (na základe chemického zloženia):
  1) Oxidy kovov a oxidačné činidlá – $ext{OsO}<em>4, ext{CrO}</em>3, ext{KMnO}<em>4, ext{K}</em>2 ext{Cr}<em>2 ext{O}</em>7$
  2) Aldehydy a alkoholy – $ext{formal-dehyde}, ext{glutaraldehyde}, ext{etylalkohol}$
  3) Organické kyseliny – $ext{kys. trichlóroctová}, ext{kys. pikrová}, ext{kys. octová}$
  4) Iné – soli kovov (HgCl₂)

• Fixačné zmesi – využívajú výhody a minimalizujú nevýhody rôznych fixatív: Zenkerova tekutina (formalín + HgCl₂ + K₂Cr₂O₇), Hellyho tekutina, Buinova tekutina (formalin + kyselina pikrová), Carnoyova tekutina, zmes Susa.

10 % Neutrálny formol

• Neutrálny vodný roztok formaldehydu – uvedený ako 10 % neutrálny formol; formulácia v texte uvádza aj vhodný roztok formaldehydu (35–40 %), čo odkazuje na koncentráciu v riadnej forme (rôzne špecifikácie v praxi).

• Je bezfarebný, silno dráždivý a potenciálne karcinogénny/mutagénny.

• Najlepšie a najčastejšie používané chemické fixatívum v praxi.

• Reaguje s amínovými skupinami, spôsobuje koaguláciu proteínov tkaniva.

• Roztok formolu sa neutralizuje CaCO₃.

Spracovanie tvrdých tkanív

• Dekalcifikácia – odvápnenie tkaniva (minerálne zložky sa odstraňujú, zostáva len organická zložka).

• Výbrusy – z tkaniva sa maceráciou odstránia všetky organické zložky; vzniknú tenké platničky, ktoré sa brusou a brúsnymi pástami spracujú do tenkých výbrusov (niekoľko μm).

• Spôsoby dekalcifikácie:

  • A) Silné anorganické kyseliny: 5 ext{% } ext{HCl} ext{ alebo } 5 ext{% } ext{HNO}_3

  • B) Slabé organické kyseliny: kys. mravčia, kys. trichlóroctová.

  • C) Komplexotvorné zlúčeniny – cheláty: Chelaton III.

  • D) Elektrolytické (anódové) odvápnenie.

• Výbrusy: maceráciou sa odstránia všetky organické zložky a získajú sa tenké platničky, ktoré sa spracujú do tenkých výbrusov.

Vypieranie, Odvodnenie, Presycovanie, Prejasnenie, Vlastné zalievanie, Zalievanie

• Vypieranie – v tečúcej vode (1–24 hod).

• Odvodnenie (dehydratrácia) – postupné zalievanie cez rad alkoholov s rastúcou koncentráciou; cieľom je odstrániť nadbytočnú vodu a pripraviť tkanivo na zalievanie zalievacím médiom.

• Presycovanie a zalievanie (infiltrácia):

  • 5A Prejasnenie – acetón (alebo benzén) – presýtenie tkaniva látkou rozpúšťajúcou zalievacie médium.

  • 5B Presycovanie – impregnácia tkaniva látkou, ktorá rozpúšťa zalievacie médium (benzén, xylén).

  • 5D Vlastné zalievanie – zalievanie do zalievacieho média (parafín, paraplast, celoidín).

  • Pri väčších excíziách sa používa papierová lodička a stuhnutý parafínový bloček na drevenú podložku.

• Druhy zalievacích médií:

  • a) parafín, paraplast

  • b) celoidín

  • c) látky miešateľné s vodou – želatína, Mowiol

Rezanie a spracovanie rezov

• Rezanie – príprava tenkých histologických rezov pomocou mikrotómov (sánkový alebo rotačný).

• Hrúbka rezov pre rutinnú histopatologickú diagnostiku: $5{-}10\ \mu\text{m}$.

• Kryostat (Zmrazovací mikrotom) – pre zmrazené rezy a rýchlu dg.

Zmrazovací mikrotom (Kryostat)

• Teplota zmrazenia tkanív: $-20^ emp{\circ}C ext{ až } -25^\circ C$.

• Rýchla histopatologická diagnostika (cca 10 min).

• Možnosť histochemického dôkazu enzýmov a lipidov.

Odstránenie zalievacieho média a farbenie

• Odparafínovanie rezov – odparafinovanie xylénom a následne alkoholmi do destilovanej vody.

• Farbenie – princíp: fyzikálne a chemické reakcie farbiva s tkanivom (adsorpcia farbiva na štruktúry).

• Cieľ farbenia: dosiahnuť kontrast medzi štruktúrami tkaniva.

• Faktory ovplyvňujúce farbenie: difúzia, veľkosť častíc farbiva, tinkčné vlastnosti tkaniva a farbiva, správna fixácia.

• Na farbenie slúžia histologické farbivá.

• Pôvod farbív: prírodné a syntetické (väčšina používa).

• Podľa fyzikálno-chemických vlastností farbív:

  • A) Kyslé farbivá – s negatívnym nábojom (ako anióny): eozín, oranž G, kyslý fuchsín, anilínová modrá.

  • B) Zásadité (bazické) farbivá – s kladným nábojom (katióny): hematoxylín, toluidínová modrá, metylénová modrá.

• Bazofília a acidofília:

  • Bazofília: farbenie štruktúr obsahujúcich kyslé látky (DNA, RNA, sulfónované glykosaminoglykány); napr. jadro, jadierko, ribozómy.

  • Acidofília (eozinofília): farbenie štruktúr obsahujúcich bázické látky (cytoplazma, erytrocyty, svalové a kolagénové vlákna).

Prehľad histologických farbiacich metód

• 1) Prehľadné histologické farbenie (HE) – kombinácia aspoň jedného zásaditého a jedného kyslého farbiva (napr. HE).

• 2) Špeciálne histologické farbenie – zvýraznenie špecifických štruktúr (napr. kolagén a elastické vlákna).

• 3) Impregnačné metódy farbenia – zvýraznenie štruktúr s afinitou ku soliam striebra alebo kovových solí (napr. argyrofilia, chromatofília).

Farbiaca metóda Hematoxylin-Eozín (HE)

• Postupové kroky HE:

  • 1) DEPARAFINÁCIA/ODPARAFÍNOVANIE – odstránenie parafínu (xylénom).

  • 2) ZAVODNENIE – postupné zvlhčenie alkoholi–voda.

  • 3) FARBENIE hematoxylín – vo vode; 4) ODVODNENIE – vodu z tkaniva odstráni etanolmi (100%, 96%, 80%).

  • 4) FARBENIE eosín – v kyslom prostredí; 5) ODVODNENIE – etanol 96%, 100% (voda vytesnína), 6) PREJASNENIE – xylén, 7) MONTOVANIE – Kanada balzam ako uzatváracie médium.

• Výsledný preparát býva trvalý.

Massonov modrý a trichrómové farbenie

• Massonov modrý a trichrómové farbenie sú špeciálne metódy na zvláštnu identifikáciu rôznych tkanív (napr. spojivové vlákna).

Impregnácia neurónov Golgiho metódou

• Golgiho impregnácia je impregnácia neurónov s cieľom zobraziť celú neurónovú štruktúru v celej ich dĺžke.

Podľa výsledku farbenia

• Farbivo alebo tkanivá môžu byť:

  • (1) Farbenie difúzne – všetky zložky tkaniva sa farbia rovnakým spôsobom.

  • (2) Farbenie selektívne – farbia sa iba určité zložky.

  • (3) Farbenie ortochromatické – tkanivo získa odtieň podľa farbiva.

  • (4) Farbenie metachromatické – tkanivo získa iný tón, než má farbivo.

• Podľa spôsobu aplikácie farbiaceho roztoku:

  • (1) Progresívne – farbia sa po určité intenzite, následne prerušenie.

  • (2) Regresívne – prefarbenie, následné odfarbenie na požadovaný odtieň.

  • (3) Sukcedánne – farbenie v niekoľkých roztokoch postupne za sebou.

  • (4) Simultánne – viac farbív v jednom roztoku súčasne.

Montovanie – uzatváranie rezov

• Účel montovania: zamedziť znehodnoteniu rezov vyschnutím a mechanickým poškodením; vytvoriť trvalý histologický preparát; zabezpečiť optickú homogénnosť prostredia (index lomu).

• Montovacie médium:

  • Miešateľné s vodou – glycerín-želatína.

  • Živice: prírodné – Kanada balzam, cedrový olej; syntetické – Entellan, Solakryl, Eukitt.

Histochemické metódy

• Histochémia sa zameriava na morfologický dôkaz a topografickú lokáciu chemicky definovaných zložiek bunky a tkanív.

• Využíva špecifické chemické reakcie (napr. PAS) – identifikácia polysacharidov (glykolipidy, glykoloproteíny, glykoproteíny, glykogén).

• Princíp PAS: oxidácia polysacharidov kyselinou jódistou na dialdehydy, ktoré reagujú so Schiffovou reagenciou a dávajú pozitívne fialovo-červené zafarbenie.

PAS reakcia

• Snímka a poznámky k reakcii so Schiffovou reagenciou – fialovo-červené zafarbenie v miestach terminálnych aldehydových skupín.

Dôkaz lipidov a lipidy v histológii

• Dôkaz lipidov sa vykonáva použitím speciálnych farbív: Sudanové farbivá (Sudan II, III, IV; Sudanová červeň a Sudanová čierna) a olejová červeň.

• Vzorky musia byť spracované na zmrazovacom mikrotóme; tkanivo nesmie prísť do styku s organickými rozpúšťadlami (acetón, xylén, benzén).

• Cieľom je identifikácia mastných kyselín, triglyceridov a fosfolipidov; dôkaz lipidových kvapôčok pomocou Sudanovej čiernej.

Imunohistochémia

• Predmetom skúmania je detekcia antigénov viazaných s protilátkou; vysoká afinita medzi antigenom a protilátkou v tkanive bez viditeľnej reakcie; vizualizáciu zabezpečujú chromogény (napr. DAB – 3,3-diaminobenzidín; vznik hnedého zafarbenia).

• Príklady: ubikvitín v nervových bunkách miechy – hnedé sfarbenie; fluorescenčne značená protilátka na tubulín.

Mikroskopické zariadenia a diely svetelného mikroskopu

• Časti: okulár, objektív, revolverový meníč, zdroj svetla, irisová clona, kondenzor, stolček, rameno, mikroskop, tubus, statív, skrutky na posúvanie preparátu, optická hlava.

• Časti sa delia na dve hlavné časti: mechanická časť a optická časť a osvetľovacia časť.

Princíp svetelnej mikroskopie

• Kondenzor – zhromažďuje a sústreďuje lúče svetla na pozorovaný objekt.

• Objektív – tvorí obraz skutočný, prevrátený a zväčšený.

• Okulár – tvorí obraz priamy, zväčšený a zdanlivý.

• Výsledné zväčšenie = násobok zväčšenia objektívu a okuláru, napr. $4\times 10 = 40$.

• Príklad: kondenzor + preparát + objektív + okulár.

Rozlišovacia schopnosť

• Najmenšia vzdialenosť medzi dvoma bodmi, ktoré sme schopní rozpoznať ako dva samostatné body:

  • Oko: $ext{≈ }0.2\ ext{ mm}$

  • Svetelný mikroskop: $ext{≈ }0.2\ \mu\text{m}$

  • Elektrónový mikroskop: $0.2\text{ nm} ext{ – } 0.05\text{ nm}$

Elektrónová mikroskopia (EM)

• Typy:

  • Transmisný elektrónový mikroskop (TEM).

  • Rastrovací elektrónový mikroskop (SEM).

TRANSMISNÝ ELEKTRÓNOVÝ MIKROSKOP (TEM)

• Prúd elektrónov prechádza cez ultratenký rez tkaniva – hrúbka rezov približne $90\text{ nm}$.

• Elektróny sú produkované vysokoteplotným ohrevom kovového vlákna v vákuu; anóda je kovová platnička s malou dierkou.

• Získaný obraz je multiplikovaný pomocou šošoviek v elektromagnetickom poli a zobrazený na fluorescenčnom plátne alebo zachytený na fotografickom papieri.

• Rozlišovacia schopnosť TEM môže dosahovať až do hrúbky $ext{≈ }0{,}2\text{ nm}.$

• Kontrast v TEM je často dosahovaný pomocou kontrastného farbenia ťažkými kovmi alebo negatívnym kontrastom.

RASTROVACÍ / SCANNING / ELEKTRÓNOVÝ MIKROSKOP (SEM)

• Umožňuje 3D pohľad na povrch štruktúry buniek, tkanív a orgánov.

• Veľmi tenký lúč elektrónov sa sekvenčne pohybuje od bodu k bodu po celom povrchu rezu a výsledný obraz je premietaný na obrazovku SEM.

Príprava tkaniva pre TEM

• Veľkosť vzorky až do $0{,}5\ ext{ mm}$; hrúbka vzorky pre TEM < $100\text{ nm}$.

• Vzorka musí byť fixovaná napr. formaldehydom, glutaraldehydom, kyselinou osmičou (osmičá), atď.

• Dehydratácia v stúpajúcom koncentračnom rade etanolu alebo acetónu.

• Vzorka je zalitá v epoxidovej živici alebo v akryláte.

• Rezanie ultratenkými rezmi pomocou skleneného alebo diamantového noža.

• Rez sa kontrastuje kontrastnými ťažkými kovmi ako osmium alebo urán; pozitívne kontrastovanie – tmavý objekt na svetlom pozadí; negatívne kontrastovanie – svetlý objekt na tmavom pozadí.

Mitochondria a Jadro

• V rámci EM sa často zobrazujú organely ako mitochondria a jadro s vysokým kontrastom v ultratenkých rezoch.

IMAGING a 3D pohľad v SEM

• SEM poskytuje 3D povrchový pohľad na štruktúry buniek a tkanív.

Mikroskopovanie – praktický postup a časté chyby

• KROKY: odokryť a zapnúť mikroskop, nastaviť kondenzor, okulár; vložiť preparát; najmenšie zväčšenie; zaostriť makro-skrutkou; zvyšovať zväčšenie; zakaždým doostriť jemnou skrutkou; pozorovať a zakresliť; popísať.

• Najčastejšie chyby: nesprávne zaostrené zorné pole; nesprávna poloha objektívu; kondenzor spustený dole; nesprávne orientovaný preparát – krycie sklíčko dole.

Histologické preparáty – príklady

• Slepačia krv (HE).

• Epidermis cibule (HE).

Praktické poznámky k zobrazeniam

• Slepačia krv – erytrocyty s cytoplazmou a jadrom (zväčšenie napr. ×200 a ×1000).

• Epidermis cibule – bunkové steny a jadro s jadierkom; zobrazenie buniek s jadierkom (×400–×1000).

Poznámky k citácii z prezentácie

• Uvedené čísla a parametre sú v súlade s popisom v transkripte a predstavujú dôležité referenčné hodnoty pre učenie histologických techník a mikroskopických metód.

• Pri praktickom použití je potrebné dodržiavať konkrétne štandardy inštitúcie a protokoly laboratória.