Människans kemi dk1: Inför tentan

Proteinstruktur

Utifrån proteinstrukturen kan man förstå proteinets fysiologiska funktion vilket i vissa fall kan hjälpa oss att studera och förstå orsaker till olika sjukdomar.

Homologer: proteiner med gemensamt ursprung. Homologi är ofta tydligt på sekvensnivå men ibland bara när man tittar på tertiärstrukturen.

Peptidbindning

Peptidbindningen är den kovalenta bindningen som håller ihop aminosyrorna i ett protein. Dessa bindningar bildas genom kondensationsreaktioner mellan karboxylgruppen (-COOH) och aminogruppen ( -NH2 ). Biprodukten som skapas i reaktionen är vatten (H2O).

Finns både som cis- och transkonfiguration. Trans-formen är vanligare eftersom den ger minst fri energi och därmed har högst stabilitet.

Terminaler i protein

N-Terminal: “Början på aminosyran“, en fri amingrupp.

C-Terminal: “Slutet/änden av aminosyran“, en fri karboxylgrupp

Strukturnivåerna för protein

Sammanfattning:

Primärstruktur: Kovalenta bindningar mellan aminosyrorna
Sekundärstruktur: Regelbundet återkommande strukturer
Tetriärstruktur: Tredimensionella strukturen hos ett protein
Kvartärstruktur: Interaktioner mellan subenheterna i ett multimert protein

Sekundärstruktur:

Beskriver veckningen av polypeptidkedjans ryggrad.

α-helix, möjliggör ett linjärt arrangemang som ger maximal bindningsstyrka och gör strukturen mycket stabil. Alla 20 aminosyror kan ingår i en alfa-helix struktur Alanin (Ala), glutaminsyra (Glu), leucin (Leu) och metionin (Met) är de vanligaste
i helixar, medan glycin (Gly), tyrosin (Tyr), serin (Ser) och prolin (Pro) är mindre vanliga.
β-flak, finns i parallel och antiparallel form. Polypeptidkedjoerna är då långstäckta och veckade, två eller flera peptidkedjor ligger bredvid varandra.
Strukturna stabiliseras av vätebindningar mellan kedjorna. Sidokedjorna är vända utåt men R-sidokedjorna räknas inte till i strukturen.

Tetriärstruktur:

Visar 3D arrangemang av allt som ingår i molekylen. Detta inkluderar sidokedjornas konformation och eventuella prostetiska grupper (ex. Heme-grupp) och hur α-helix och β-flak är arrangerade i förhållande till varandra.

Veckas beroende på laddning, storlek och hydrofobicitet. Aminosyrorna sidogrupper kommer att påverka bidningarna mellan aminosyrorna i polypeptidkejdan.Stabiliseras av vätebindningar, svavelbindningar, jonparbindningar (elektrostatiska interaktioner), hydrofoba interaktioner (dispersionskrafter)

• Minst en sidokedja ska vara involverad i bindningen

• Positionen av icke-proteindelar anges också (till exempel Heme grupp)

Olika typer av tetriärstruktur:

Fibrösa protein (strukturerade)

Globulära protein (strukturerade)

IDP (ostrukturerade protein)

Kvartärstruktur:

Beskriver interaktionerna mellan subenheterna i ett multimert protein. Ett protein som består av fler än 1 subenheter harkvartärstruktur . Stabiliseras av vätebindningar, svavelbindningar, jonparbindningar (elektrostatiska interaktioner), hydrofoba interaktioner (dispersionskrafter)

mellan subenheter.

Olika peptidkedjor ska vara involverad i bindningen

Denaturering

Denaturering av ett protein innebär att dess tertiära struktur bryts ned, vilket leder till att proteinet veckas upp.

Olika sätt denaturering kan ske på:

Värme/hög temperatur
Extremt pH: stör elektrostatisk interaktion
Detergenter: stör hydrofoba interaktion. Laddade aminosyror kan även störa elektrostatisk interaktion.
Denaturanter som urea: , nya vätebidningar bildas som stärkare än dem i molekylen
Merkaptoetanaol: stör SS-bryggor (disulfidbryggor)

Deanturering är inte alltid reversibel

Proteiners funktion

Samlingen av proteinerna i en cell avgör dess hälsa och funktion.

Proteinerna ansvarar för nästan alla uppgifter i cellens liv, inklusive cellens form och inre organisation, produkttillverkning och avfallshantering samt rutinunderhåll.
Proteiner tar emot signaler från utsidan av cellen och mobiliserar intracellulära svar.
De är cellens arbetshäst/”anställda” makromolekyler och är lika olika beroende på den funktion som de ska utföra.

Olika proteinstrukturer behövs för att kunna uppfylla olika funktioner. Ex katalysatorer, transportörer, försvar.

Fibrösa protein (strukturerade)

Ex. kollagen

Långsträckt eller fibrös form
Kan ha α-helix eller β-flak
Är olösliga i vatten
Strukturella roll i cellen: skydd, stöd, cell-cell adhesion, cell-extracellular matrix adhesion
lagen

Globulära proteiner (strukturerade)

Ex. hemoglobin eller myoglobin

De här globulär/ sfäriskform
hydrofoba rester i sin kärna och hydrofila rester på sin yta, vilket gör dem lösliga i vattenhaltiga miljöer

Har betydande delar av α-helix och β-sheet
Har kompakta strukturer
Funktioner: enzymer, hormoner, transportproteiner...

Begrepp för globulära protein:

Apoprotein = protein utan prostetisk grupp (Heme)

• Holoprotein = Apoprotin +kofaktor

• Kofaktor= något som ger nya egenskap till proteiner, ex metalljon eller oorgansik molekyl

IDP (naturligt ostrukturerade)

De har färre intramolekylära interaktioner och exponerar en större del av sin sekvens för den omgivande lösningen.
IDP är en samling av mycket olika konformationer som snabbt kan förändras
som svar på de fysikalisk-kemiska förändringar i deras omgivning. Tack vare sin anpassningsförmåga kan oordnade regioner interagera med olika makromolekyler, vilket gör dem idealiska för att svara på att reglera signaler.
Oförmågan att veckas beror ofta på en otillräcklig andel hydrofoba aminosyror för att bilda en hydrofob kärna.

Vilka proteiner har ostrukturerade regioner?

Receptorer
Transportörer
RNA-bindande proteiner

Felveckning

Proteiner kan bli felvecklade när de produceras. Detta kan exempelvis ske genom att proteiner associera sig med andra proteiner innan de slutför sin veckningsprocess

Vissa proteiner behöver “chaperoner” för att veckas rätt. Man kan säga att chaperoner förhindrar felveckning.

Amyloider

Amyloider är proteinaggregat som uppstår när vissa proteiner felveckas och klumpar ihop sig. De kan ha både fysiologiska och patologiska roller beroende på sammanhanget. Amyloider kan smitta/rekrytera protein som ännu inte felvecklats till att bli felvecklade och på så sätt förvärra/progressera sjukdomar.

Patologiska roller av amyloider:

Neurodegenerativa sjukdomar: Amyloidfibrer är kopplade till sjukdomar som:
Alzheimers sjukdom: Beta-amyloidpeptider bildar plack i hjärnan.
Parkinsons sjukdom: Alfa-synuklein bildar Lewy-kroppar.
Prionsjukdomar: Felveckade prionproteiner orsakar sjukdomar som Creutzfeldt-Jakobs sjukdom.

Prioner

Prioner är små glykoproteiner som finns i cellmembranet i nervvävnad. Prionsjukdomar uppstår när en vanlig Prion (PrP) felveckas (PrPD). De felvecklade prionerna smittar sedan andra prioner som även dom blir felvecklade.

Ex. prionsjukdomar:

Creutzfeldt-Jakob sjuksom (CJD)
Galna kosjukan

Protein-ligand interaktioner

Proteiner binder ligander (L) och blir “mättade” vid hög ligandkoncentration. Mättad betyder att i princip alla proteiner har bundit en ligand. En ligand kan vara ett annat protein, DNA, RNA, socker, lipid eller en annan molekyl. De flesta läkemedel är ligander till proteiner (oftast enzymer).

Affinitet

Affinitet är ett direkt mått på bindningsstyrkan mellan protein och ligand

Specificitet

Om ett protein binder ligand A 10 gånger starkare än det binder ligand B så kan man säga att proteinet är 10 gånger mer specifik för ligand A jämfört med ligand B.

Enzymer

Enzymer är proteiner som katalyserar kemiska reaktioner genom att sänka aktiveringsenergin.

De binder till substratets (s) i dne aktiva ytan (active site) så att substratet kan omvandlas till produkt. Aminosyrorna i aktiva ytan är organiserade på ett sådant sätt att reaktionens transition state (TS) binder starkare än substratet(-en). Bindningsenergin används för att destabilisera substraten och sänka aktiveringsenergin.

Enzymer ändrar inte ΔG.
Har oftast hög substratspecificitet

För de flesta enzymer fungerar bara ett substrat, men för vissa ensymer kan de katalysera omvandlingen av flera olika substrat.

Multienzymkomplex

Enzymer består också ibland av flera subenheter som katalyserar olika reaktioner, så att flera katalytiska aktiviteter samlas i ett stort komplex.

Ex: pyruvatdehydrogenas

Reaktioner

En termodynamiskt möjlig reaktion sker med låg hastighet om den kräver hög aktiveringsenergi. Enzymer minskar aktiveringsenergin och höjer därmed reaktionshastigheten

Begrepp:

Kofaktor: en kemisk förening som inte är ett protein och som behövs för den biologiska funktionen
Koenzym: om kofaktorn är organisk, eller metallo-organisk kallas den koenzym
Kosubstrat: koenzym som är “löst bundet”, det byts ut i varje katalytisk cykel
Prostetisk grupp: hårt bundet koenzym, sitter kvar mellan varje katalytisk cykel
Apoenzym: enzym utan sin kofaktor
Holoenzym: enzym med sin kofaktor

Mätning av enzymers hastighet

Vad är enzymers hastighet (eller ”aktivitet”)?

Reaktionshastighet, generellt: hur mycket produkt som bildas per
tidsenhet (=hur mycket substrat som förbrukas per tidsenhet).
Reaktionshastighet, v = Δ[P]/Δt, Enhet: M/s

Hur mäter man denna aktivitet?

Vi vill mäta hur koncentrationen av produkt (eller substrat) förändras över tid i närvaro av en viss koncentration enzym. Det enklaste sättet att göra detta är om man kan använda en spektrofotometer. Men då krävs att absorbansen för substrat och produkt skiljer sig åt.

Lambert-Beers lag ger koncentrationen:
A = ε l c
A, absorbansen vid en viss våglängd
l, kyvettlängden (enhet cm)
ε, extinktionskoefficienten (enhet M -1cm -1)
c, koncentration, i vårt fall [P] eller [S]

Ju högre substratkoncentration desto snabbare kan enzymet binda substrat till aktiva ytan. Ett enzym mättas vid hög substratkoncentration, när den kemiska omvandlingen eller frisättande av produkt blir långsammare än substratbindning

Vmax = den hastiget som enzymet arbetar på när det är mättat med substrat, den extrapolerade teoretiskt maximala hastigheten vid en viss enzymkoncentration. Vmax är där grafen börjar plana av och bli linjär.
Km: om vmax=4 är km x värdet när vmax/2
kcat -värdet säger hur många gånger per sekund som en enzymmolekyl kan omvandla substrat till produkt, när det arbetar på maxhastighet

Faktorer som påverkar enzymaktivitet

Temperatur: Enzymkatalyserade reaktioner (liksom de flesta kemiska reaktioner) ökar med ökande temperatur. Enzymets denatureringstemperatur varierar med
organismens fysiologiska temperatur.
pH: Ett enzyms pH-optimum återspeglar ofta pH:t för den plats där enzymet verkar. Aktiviteten går oftast ned vid låga och höga pH värden pga denaturering.
Inhibering: Enzymer kan inhiberas (hämmas) av olika molekyler. Detta sker naturligt för att reglera enzymers aktivitet.
- Kompetitiv inhibitor tävlar med substratet om att binda till aktiva ytan.
- Irreversibel inhibitor binder oftast till aktiva ytan och bildar en kovalent binding så att inhibitorn inte kan lossna.
- Allosterisk inhibitor binder inte till aktiva ytan utan till ett allosteriskt site.
- Irreversibel inhibitor: Binder oftast till aktiva ytan och bildar en kovalent bindning så att inhibitorn inte kan lossna

Enzymaktivitet kan regleras genom fosforylering av kinas och defosforylering av fosfatas.

Fosforylering fungerar som en av eller påknapp för enzymaktiviteten.

Reaktionsmekanismer

Fri energi (ΔG), entalpi (ΔH) och entropi (ΔS)

ΔG = G Produkter – G Reaktanter Enhet: kJ/mol, kcal/mol

ΔG < 0 i en spontan reaktion

Entalpi (ΔH):

Entalpin för ett system (till exempel ett antal molekyler) är ett mått på systemets energiinnehåll med avseende på bindningarnas styrka. Om det vid en reaktion bildas starkare bindningar, så minskar entalpin och värme avges.

∆H= H produkt - H reaktant

Det betyder att om bindningarna blir starkare så är ∆H<0

Entropi (ΔS)

Entropin (S) för ett system är relaterad till sannolikheten och/eller oordningen för

systemet.

∆S= S produkt - S reaktant

Om oordningen ökar så blir ∆S>0 (dvs något blir mindre strukturerat), och -T∆S<0.

Exotermisk process ΔH<0, värme avges

Endotermisk process ΔH>0, värme tas upp

Fri energi (ΔG)

Skillnaden i ΔG mellan reaktanter och produkter är ”drivkraften” för de kemiska reaktioner som definierar liv. Stora skillnader i ΔG ger icke-reversibla reaktioner, reversibla reaktioner (jämviktsreaktioner) har små skillnader i ΔG.

Höjden på energibarriärerna bestämmer hur snabbt

reaktionerna sker och energibarriärens höjd regleras av enzymer.

ATP

ATP (adenosintrifosfat) kan driva energetiskt ofördelaktiga processer, som inte

går av sig själv (t ex röra på musklerna) genom att koppla processen till hydrolys av

fosfatgrupperna. ATP nybildas främst i glykolysen och vid oxidativ fosforylering.

Kolhydrater

Klassificering efter antal kol

Trios (3)
Tetros (4)
Pentos (5)
Hexos (6)

D formen där OH gruppen är till höger för det näst sista kirala kolet är vanligast i naturen.

Enatiomerer: spegelbilder, dvs D och L socker

Epimerer: spegelbilder som endast skiljer sig runt ett kol

Diastereomerer: skiljer sig runt mer än ett kol

Aromerer: skiljer sig kring den anomera kolatomen

De viktigaste monosackariderna

Monosackaridderivat, får andra egenskaper än själva sockret

Fosfatsocker
Deoxyribos
Aminosocker (ex glukosamin)
Sockeralkoholer (glycerol)
Sockeralkoholer (ex glycerol)
Sockersyror (ex glukuronsyra)

Oligosackarider

Oligosackarider är kolhydrater som innehåller två eller fler monosackarider. Dessa sitter ihop med glykosidbindning mellan den reducerande och icke-reducerande änden.

De viktigaste disackariderna: Cellbios, sackaros och maltos.

Funktion:

Oligosackarider används ofta för specifika funktioner som cellulär kommunikation och igenkänning, särskilt på cellytan i form av glykolipider och glykoproteiner.

Polysackarider- Homoglykaner

Homoglykaner: Om kedjorna består av samma monosackarid kallas de för homopolysackarider eller homoglykaner.

Stärkelse: Amylos, amylopektin
Glykogen
Cellulosa: Vätebindningar, kan packas mycket tätt
Chitin

Amylos, amylopektion och glykogen är grenade strukturer och kan därför brytas ned snabbare.

Glykokonjugat- Heteroglykaner

Heteroglykaner: Om de består av flera olika monosackarider kallas de för heteropolysackarider eller heteroglykaner.

Hetorglykaner ingår i glykokojugat (=kolhydrater som är kovalent bundna till lipider eller proteiner).

Glykokonjugat: Dessa är molekyler där kolhydrater är kovalent bundna till proteiner eller lipider, och de finns huvudsakligen på cellmembranets utsida. De spelar en viktig roll i att:

Skydda proteiner från enzymatisk nedbrytning.
Fungera som signal- och igenkänningsmolekyler, exempelvis i immunförsvaret och cell-cell-interaktioner.

Glykoproteiner:

Kolhydrater är kovalent bundna till proteiner via N-bundna (till asparagin) eller O-bundna (till serin/treonin) sockerrester.
De har viktiga roller i biologiska processer som proteinstabilitet, proteinveckning och cellkommunikation.

Glykokalix:

Ett skyddande och funktionellt kolhydratlager som bildas av glykokonjugat på cellmembranets yta.
Detta lager är centralt för cellens interaktion med omgivningen, exempelvis genom att skydda mot mekanisk och kemisk skada samt underlätta celligenkänning.

Proteoglykaner:

Här dominerar kolhydratdelen, som är mycket större och mer komplex än i glykoproteiner.
Består av en kärnproteinstruktur bunden till en eller flera glykosaminoglykaner (GAGs), som är långa, ogrenade kolhydratkedjor.
Proteoglykaner är viktiga för att ge struktur åt extracellulär matrix, binda till signalmolekyler och reglera cellens mikromiljö.

Peptidoglykaner:

En viktig komponent i bakteriers cellväggar, där de ger styrka och skydd mot osmotisk stress.
Består av ett nätverk av polysackarider korsbundna med peptidkedjor.
Avgörande för bakteriers struktur och används för att skilja mellan Gram-positiva och Gram-negativa bakterier vid gramfärgning, där tjockleken på peptidoglykanlagret spelar en central roll.

Lipider

Fettsyror är den minsta gemensamma nämnaren för lipider.

Mättade fettsyror: inga dubbelbindingar, endast enkelbindningar

Omättade fettsyror: dubbelbindingar, blir delvis “stela“ av dubbelbindingarna och kan därför inte packas för tätt. Detta är en av anledningarna till att fiskar som bor i kallare vatten har större mängd omättade fettsyror i deras membran och liknande så de kan behålla sin fluiditet och funktion. Dubbelbindingar ger även en lägre smältpunkt.

Fettsyrans egenskaper bestäms av kedjelängden och antalet dubbelbindningar.

Lagringsformen för lipider är Triacylglycerol.

Namngivning

Mättade fettsyror (inga dubbelbindningar)

Namnges baserat på antalet kolatomer i kedjan och slutar på "-ansyra".

Exempel: Butansyra (C4:0) – 4 kolatomer, ingen dubbelbindning.

Omättade fettsyror (en eller flera dubbelbindningar)

Positionering av dubbelbindningar:

Numreringen börjar från karboxylgruppen.
Dubbelbindningens position anges med siffror och prefix som "cis-" eller "trans-"(beroende på geometrin kring dubbelbindningen).

Exempel: cis-Δ9-oktadekensyra (C18:1) betyder att dubbelbindningen är mellan kol 9 och 10, och den har en "böjd" cis-konfiguration.

Omega-notation:

Räkningen börjar från metyländen (den andra änden av fettsyran).
En fettsyra med en dubbelbindning vid tredje kolet från metyländen kallas omega-3 (ω-3). Är dubbelbindningen istället vid 6:e kolet från metyländen är det en omega-6 (ω-6).
Exempel: Alfa-linolensyra (C18:3 ω-3).

Biologiskt viktiga fettsyror

Mättade:

12:0 Laurinsyra (Lauric acid): CH3-(CH2)10-COOH

14:0 Myristinsyra (Myristic acid): CH3-(CH2)12-COOH

16:0 Palmitinsyra (Palmitic acid): CH3-(CH2)16-COOH

18:0 Stearinsyra (Stearic acid): CH3-(CH2)16-COOH

Enkel omättade:

16:1 Palmitoleinsyra (Palmitoleic acid): CH3-(CH2)5-C=C-(CH2)7-COOH

18:1 Oleinsyra/Oljesyra (Oleic acid): CH3-(CH2)7-C=C-(CH2)7-COOH

11:2

Siffran till vänster (11) anger antalet kol i föreningen, siffran till höger (2) anger antalet dubbelbindningar.

Lipider som är fleromättade (dvs 2+ dubbelbindingar) måste tillföras genom livsmedel.

Sfingolipider

ceramider- fettsyra bunden till C-2 aminogruppen i sfingosin

Cellmembranets struktur: Sfingolipider bidrar till stabilitet och fluiditet i cellmembranet, särskilt i specialiserade områden som lipidflottar.
Signalering: De deltar i intracellulär och intercellulär signalering som reglerar processer som celldelning, apoptos och inflammation.
Celligenkänning: Sfingolipider fungerar som igenkänningsmolekyler på cellytan, viktiga för immunsystemet och cell-cell-interaktioner.
Skydd: De skyddar cellen genom att bilda ett barriärlager mot yttre kemisk och enzymatisk påverkan

+fettsyra= ceramid

+Fosfat & kolin= sfingomyelin

+kolhydrater= Glykosfingolipid

Steroider

Kolesterol: ursprung för syntes av gallsalter
Steroidhormoner:
Naturliga hormoner: Östradiol/östrogen, Testosteron, Progesteron
Syntetiska steroider: Noretynodrel, Mifepriston (RU-486), Metandrostenolon

Eikosanoider

Eikosanoider är lipider med hormonliknande egenskaper. Bland annat behövs de essentiella

fettsyrorna för syntesen av eikosanoider: alfa-linolensyra och linolsyra (omega 3 & 6)

Membraner

Var finns membraner? Plasmamembranet, Mitokondrierna, Cellkärna, Golgi-apparaten, Endoplasmatisk retikulum, Lysosom

Funktioner:

Barriär mellan in och ut ur cellen

• Reglera transporten av ämnen in och ut ur cellen

• Katalyserar reaktioner

• Överföra signaler från utsidan av cellen in i cellen

Vilken typ av lipider finns i cell membraner?

Glycerofosfolipider
- Phosphatidylserine (PS)
- Phosphatidylcholine (PC)
- Phosphatidylethanolamine (PE)
Sfingolipider
- Sfingomyelin
- Cerebrosider

• Glykolipider

Kolesterol

In och utsida på membranen tenderat att olika ut för att tvåskiktet är böjt. Större molekyler tenderar att förekomma i det yttre lagret och mindre molekyler tenderar att förekomma i det inre skiktet.

Membranproteiner

Integrala proteiner, hel eller delvis inbäddade i membranet. Behövs detergent för att
lösa de.
Perifert proteiner, bundet till lipider eller annat proteiner. Kan lösa de med hjälp av
salt eller ändra pH.

Membrantransport

Diffusion:

O2, CO2, steroidhormoner, H2O
Följer koncentration gradient
Kräver inte energi

Faciliterad diffusion/Passiv transport

kanal eller bärar protein konf. modifiering
Följer koncentration gradient
Kräver inte energi

Aktiv transport

Mot koncentration gradient
Kräver energi
Kräver bärar protein 48

Primär aktiv transport

Transporten är direkt kopplad till hydrolysen av en molekyl med hög energi, t.ex. ATP
Natrium-kaliumjonpump (Na+/K+ jonpump)

Sekundär aktiv transport

Drivs av H+ gradient
Protonpumpar: Aktiva transportörer som skapar H+ gradienter

Separationsteknik

Vad är viktigt att tänka på innan separation:

Att man isolerar rätt sak med hjälp av pH, temperatur, lösningsmedel mm
Mängd som behövs
källan och dess tillgänglighet

Egenskaper att nyttja för separation

Laddning: Jonbyteskromotografi på katjon och anjonbytare
Affinitet: Bindningsbenägenhet mot en specifik ligand, affinitetskromotografi
Storlek: Storlekskromotografi, SDS-PAGE
Hydrofobicitet: HIC eller RP

Begrepp

Ligand: molekyl/kemisk struktur kovalent kopplad till matrisen för att ge matrisen en särskild egenskap
Preparativ metod: för att få fram en molekyl att studera
Kvantitativ metod: vilka ämnen finns
Kvantitativ analys: mängd av ett ämne

Jonbyteskromotografi

Princip: Separationsmetod baserad på laddning. Molekyler binder till en jonbytarkolonn via elektrostatisk interaktion, beroende på deras laddning och pH i lösningen.
Nyttjar den isoelektriska punkten (IP), dvs den punkt där nettoladdningen är =0. Om pH är under IP så är laddningen negativ och pH:t över laddningen positiv.

Kolonner:

Katjonbytare: (-) Negativt laddad matris binder till positiva joner (t.ex. proteiner med nettoladdning + vid aktuellt pH).
Anjonbytare: (+) Positivt laddad matris binder negativa joner (t.ex. proteiner med nettoladdning - vid aktuellt pH).

Eluering:

Bundna joner släpps genom att:

Ändra salthalten (joner konkurrerar ut bundna ämnen).
Justera pH för att förändra nettoladdningen på analyten.

Affinitetskromotografi

En separationsteknik som bygger på specifika bindningar mellan en molekyl i provet och en ligand som är bunden till en kolonnmatris. Kan användas för att rena proteiner, antikroppar, enzymer eller andra biomolekyler med hög specificitet.

Princip:

Ligand: En molekyl (t.ex. antikropp, enzym eller receptor) är immobiliserad på matrisen och binder specifikt till målmolekylen.
Bindning: När provet passerar genom kolonnen binder målmolekylen till liganden medan andra ämnen sköljs bort vid eluering.

Eluering:

Målmolekylen släpps från kolonnen genom att ändra pH, saltstyrka eller tillsätta en konkurrerande molekyl. Mer specifikt:

Ändra pH för att bryta interaktioner
pH ändring i kombination med denaturerande regens, för vissa starka bindingar
En kompetitor som binder till liganden och förtränger analyten från att bind atill den
Kompetitor som binder till analyten och tävlar ut dess bindning till liganden

Affinitetskromotografi är likt jonbyteskromotografi men den största skillnaden är i valet hur man ska eluera den bundna analyten. Eftersom det är en specifik bindning vid affinitetskromotografi så krävs det en specifik metod för att eluera.

Antikroppsbaserad analys

Dot blot:

Antikroppen används för att binda till ett antigen applicerat på ett membran. Det behövs en antikropp med markör som tex lyser eller är kopplat till ett enzym och att ett enzymsubstrat tillsätts.

Vilka markörer finns:

Enzym:

+Hög känslighet

-Substrat krävs (extra steg)

-Stora, kan påverka bindingen till antigen

- Stabilitet, kan tappa enzymaktivitet

Biotin

+Liten molekyl

+kan bindas av avidin eller streptavidin

+Kan användas för att koppla enzymer

Radioisotop

+Mycket liten

+Mycket hög känslighet

-Krävs speciell utrustning och tillstånd

Fluorecerande molekyler

Steg och varför:

Positiv och negativ kontroll
Blockera provet mha ex serumalbumin eller mjölkprotein som sätter sig på de fria ytorna
skölj ordentligt för att få bort antikroppar som inte bundit

Direkt analys:

Går snabbt och ingen risk för korsreaktioner eftersom det bara är 1 antikropp.

Indirekt analys:

Två antikroppar i rad behövs frö att synliggöra antigen. Går att använda på många antikroppar, felra bindingställen kan även ge förstärkt signal. Denna metod tar längretid och innebär fler steg vilket resulterar i att det blir fler felkällor och misstag.

SDS-PAGE

Är en metod för att separera proteiner baserat på deras storlek. Kan även användas för att bestämma proteiners molekylvikt, kontrollera renheten hos ett proteinprov och analysera proteiners sammansättning i ett prov.

Detta sker genom

Denaturering:

Proteiner behandlas med SDS, ett detergent som bryter icke-kovalenta bindningar och ger proteiner en negativ laddning proportionell mot deras storlek.
Proteiner värms ofta tillsammans med ett reducerande medel (t.ex. DTT eller β-merkaptoetanol) för att bryta disulfidbindningar.

Gelelektrofores:

De behandlade proteinerna appliceras på en polyakrylamidgel och utsätts för ett elektriskt fält.
Proteiner migrerar mot den positiva polen, där mindre proteiner rör sig snabbare genom gelens porer än större proteiner.

Detektion:

Efter separation färgas proteinerna (t.ex. med Coomassie Brilliant Blue eller silverfärgning) för att visualisera banden.

Faktorer som kan påverka resultatet

för mycket eller ojämn saltkoncentration i proverna
Läckage från brunnar
Dålig strömföring
Om proverna får gå för lång/kort tid

HIC

“Hydrpphobic interaction chromatography“, isolerar proteiner man sedan kan använda

Matrisen måste modifieras med hydrofoba ligander

Fördelar HIC:

Provlösningen innehåller salt, salt behövs för att tvinga proteinerna att binda till de hydrofoba liganderna
separationsprincipen beror på ordningen av H2O runt den hydrofoba liganden

Hur går det till

Använder en hög slatkoncentration i början

Jämviktning

Hög saltkoncentration

Provet sätts på

Molekyler som har hydrofoba delar binder till liganden

Elution

Påbörjas genom att reducera salthalten i elueringslösningen. Elutionen fortsätter tills inget salt är kvar och kolonnen tvättas med saltfri lösning.

RPC

Separationsprincipen baseras på direkt hydrofob interaktion mellan hydrofoba ytan på matrisen och de hydrofoba delarna i proteinet. Kan bara användas för prover som är saltfria. Använder en linjär eller stegvis gradient av organiskt lösningsmedel. Molekylerna elueras beroende på antalet hydrofoba interaktioner när lösningsmedlet tillsätts.