la recombinaison et le clonage

outils nécessaire: enzyme de restriction, ligase, vecteur, cellule hôte, insert

les enzymes de restricitons:

elles viennent des bactéries et servent à la defense contre de l’ADN étranger. Elles n’attaquent pas leur propre matériel génétique car celui ci est méthylé

Il existe donc des enzymes endonucléase spécifique à une séquence qui détruit cette séquence spécifique et des enzymes methylase qui méthylent et protègent

il existe plusieurs type d’enzyme de restriction suivant le lieu où elles coupent, nous utilisons le type II qui coupe des régions palindromiques de 4-8 pdb et le type IIS qui coupe ~20 nucléotides plus loin (comme elles coupes des régions palindromiques, elles coupent les deux cotés) . Elles ont besoin de magnesium mais pas d’ATP. Après la coupe, il reste une extremité 5’ phosphate et une 3’ OH.

Afin de recoller, la ligase elle demande de l’ATP

certaines enzymes de restrictions sont sensibles au methylage de l’ADN

les plasmides

ce sont des vecteurs à l’intérieur desquels on introduit des inserts d’ADN. Ils doivent contenir: une origine de réplication, un marqueur qui aide à la séléctrion comme la résistance à un antibiotique et plusieurs zones de clonages (site de restriction unique)

les bactéries hôtes

Pour qu’elles soient idéale, il faut que les bactéries hôtes n’ait pas leur propre système de restriction, on veut aussi inactiver le gène qui dégrade l’ADN méthylé étranger.

Dam méthylase

La Dam méthylase est une enzyme spécifique qui reconnaît la séquence d'ADN GATC et y ajoute un groupe méthyle à l'adénine. Les E. coli normaux expriment l'enzyme Dam méthylase, ce qui entraîne la méthylation de leur ADN à la séquence GATC. (Après la réplication, l'ADN est d'abord hémi-méthylé). Le système de réparation des mésappariements utilise la méthylation de l'ADN pour distinguer le brin parental du brin fils. Le brin fils, non méthylé, est alors réparé si des mésappariements sont détectés. On utilise DAM pour méthylé l’ADN matrice pendant la PCR et ensuite on peut employer une autre enzyme qui digère justement cet ADN methylé

Dcm méthylase

meme mrpincipe

on peut tester la méthylation de l’ADN avec le traitement à deux enzymes de restriction, une sensible l’autre pas. Si on obtient des résultats différent, l’ADN est methylé