Parazitické protista 1

Parazitické protista

Úvod do parazitológie jednobunkovcov

  • Epidemiológia a patológia protozoárnych infekcií

  • Metódy výskumu protozoárnych infekcií

Terminológia

  • Protista - súhrn bližšie nepríbuzných eukaryotických organizmov, ktoré sú väčšinou jednobunkové

  • Parazit – organizmus, ktorý sa celý svoj život alebo v určitom životnom období vyskytuje na alebo v tele iného organizmu = hostiteľa, ktorý poskytuje parazitovi výživu a látky potrebné pre rozmnožovanie. Parazit hostiteľa poškodzuje

  • Komenzál – nepatogénny organizmus využívajúci hostiteľa len ako životné prostredie a na získavanie látok potrebných pre výživu. Hostiteľa nepoškodzuje (napr. Opalina ranarum, …)

Formy parazitizmu

  • Parazity obligátne – adaptované na výlučne parazitický spôsob života (napr. trypanozómy, Plasmodium)

  • Parazity fakultatívne – parazitujú príležitostne (napr. amfizoické meňavky)

Parazit - podľa charakteru životného cyklu

  • Stenoxénny parazit – špecializovaný na 1 alebo veľmi malý počet hostiteľov

  • Euryxénny parazit – špecializovaný na viacero druhov hostiteľov v jednotlivých fázach cyklu

  • Hyperparazit – parazituje na inom druhu parazita (mikrosporídie v pásomniciach)

  • Polyxénny parazit – má viacerých hostiteľov

  • Monoxénny parazit – má 1 druh hostiteľa

Parazit - podľa lokalizácie

  • Ektoparazity – na povrchu tela hostiteľa

  • Endoparazity – vnútorné, intracelulárne a extracelulárne vo vnútorných orgánoch:

    • Črevné (intestinálne, enterálne) – Entamoeba, Giardia,…

    • Krvné (hematotropné) - Trypanosoma, Plasmodium,…

    • Tkanivové (histotropné) – Toxoplasma,…

    • Kožné (dermotropné) – Leishmania,…

    • Dutinové (kavitárne) – Trichomonas,…

Hostiteľ

  • Definitívny (konečný) hostiteľ – hostiteľ u ktorého prebieha sexuálne rozmnožovanie parazita

  • Medzihostiteľ – prebieha v ňom vývoj a rozmnožovanie asexuálnych foriem parazita

  • Paratenický hostiteľ (transfer host) – medzihostiteľ bez daľšieho vývinu parazita, ktorý pokračuje až v nasledujúcom hostiteľovi. Často nie je pre dokončenie životného cyklu potrebný

  • Hostiteľ aberantný (abnormálny) – organizmus, v ktorom parazit nemôže ukončiť svoj životný cyklus alebo sa nemôže vyvíjať

  • Hostiteľ príležitostný (náhodný, akcidentálny) – organizmus, v ktorom sa parazit za normálnych okolností nevyskytuje

  • Rezervoárový hostiteľ – stavovec, v tele ktorého prežívajú parazity v prírode a z ktorého sa môžu šíriť na iných hostiteľov (človeka)

  • Vektor – prenášač, hostiteľ aktívne zabezpečujúci šírenie infekčných štádií parazita (napr. komáre, glosiny pri cicaní krvi)

Stavba bunky parazitických protista

  • Základ – eukaryotická bunka:

    • Cytoplazmatická membrána + glykokalyx – ohraničenie bunky, ochrana, príjem potravy

    • Cytoplazma – ektoplazma + endoplazma

    • Jadro (nucleus) – riadiace centrum bunky, DNA

    • Jadierko (nucleolus) – syntéza RNA

    • Mitochondrie – metabolizmus energie; u mnohých absentujú (Giardia, Entamoeba, Cryptosporidium…)

    • Kinetoplast – časť trubicovitej mitochondrie zástupcov Kinetoplastida

    • Endoplazmatické retikulum – syntéza lipidov (hladké ER), proteínov (granulované ER)

    • Golgiho aparát – sekrečná funkcia; u niektorých absentuje (Giardia, Entamoeba)

    • Fagozómy – potravné vakuoly

    • Lyzozómy – vakuoly s trávacimi enzýmami

Príjem potravy, pohyb, rozmnožovanie

  • Príjem potravy – fagocytóza, pinocytóza, osmoticky

  • Pohyb – pseudopódie, bičíky, brvy, undulujúca membrána

  • Rozmnožovanie:

    • Nepohlavne:

      • Binárne delenie – vznik 2 dcérskych jedincov

      • Mnohonásobné delenie – vznik vyššieho počtu dcérskych jedincov

    • Pohlavne:

      • Gametogamia – splývanie gamét

      • Gamontogamia – splývanie gamontov (pohlavných jedincov)

Mnohonásobné delenie

  1. Rozetové delenie

    • bunky pred rozdelením spojené posteriórnymi koncami (Trypanosoma spp.)

    • delenie cytoplazmy je oneskorené oproti deleniu jadra

  2. Sporogónia – vznik rezistentných štádií – oocýst a sporocýst, obsahujúcich sporozoity – infekčné štádiá (Apicomplexa)

  3. Schizogónia (merogónia) – vznik schizontov (merozoitov) - opakovaným delením jadra a rozpadom materskej bunky, funkcia – množenie parazita v tele hostiteľa

  4. Endopolygónia – vznik viacerých dcérskych jedincov vo vnútri materského jedinca (Apicomplexa, Toxoplasma spp.)

  5. Endodyogónia – vznik dvoch dcérskych jedincov vo vnútri materského jedinca (Apicomplexa, Toxoplasma spp.)

Pohlavné rozmnožovanie

  1. Gametogamia – splývanie haploidných mikrogamét a makrogamét u Apicomplexa (vznik zygoty, pohyblivá zygota = ookineta, transformuje sa na oocystu)

  2. Gamontogamia – splývanie gamontov (pohlavných jedincov) spojené s výmenou genetického materiálu – konjugácia u Ciliophora

Životné cykly a formy

  • Zohrávajú zásadnú úlohou pri šírení infekcií

  • Životné formy parazitických prvokov: trofozoit, trofozoit bičíkatý, ameboidný, sporozoit, schizont, cysta, oocysta, sporocyta, tkanivová cysta

Adaptačné mechanizmy

  1. stratégie na rozpoznanie a vyhľadanie hostiteľa

  2. prichytenie, prienik do bunky hostiteľa

  3. prispôsobenie metabolizmu na látky získavané z tela hostiteľa

  4. únik pred obrannou odpoveďou hostiteľa

  5. vhodné reprodukčné stratégie

Morfologické adaptácie

  • Lokomočné systémy – zväčša pôvodom z voľne žijúcich foriem (bičíky, brvy, pseudopódie)

    1. kĺzavý a krútivý pohyb Apicomplexa (aktín + myozín)

    2. undulujúca membrána Kinetoplastida, Trichomonadida

    3. pseudopódie Entamoebida a amfizoických meňaviek

  • Adhézne systémy – na fixáciu k hostiteľským bunkám

    • prísavný disk u Giardia spp.

    • prichytávacia plôška u kryptosporídií

    • prichytávacie pseudopódie

Fyziologické adaptácie

  • Penetračné procesy – intracelulárne parazity - prienik do bunky hostiteľa

    • Aktívne: pohyb + penetračné organely (apikálny komplex u Apicomplexa) – parazit ostáva v parazitofórnej vakuole (v prípade babézií z nej prechádza do cytoplazmy)

    • Pasívne: fagocytóza hostiteľskou bunkou (Leishmania spp. – vo fagolyzozómoch)

Biochemické a molekulárne adaptácie

  • Nutričné adaptácie

    • príjem esenciálnych aminokyselín,

    • príjem intaktných proteínov endocytózou

    • príjem purínových nukleozidov (zväčša pri neschopnosti syntézy purínových nukleotidov de novo)

    • príjem pyrimidínových nukleozidov (Trichomonas, Giardia)

    • príjem lipidov (zväčša minimálny)

  • Produkcia proteáz (proteolytických enzýmov)

    • degradujú proteíny hydrolýzou väzieb medzi aminokyselinami

    • dôležité pre metabolizmus aminokyselín parazita

    • dôležité pre patogénnu aktivitu – invázia do tkanív a buniek hostiteľa

      • Cysteínové proteázy – Toxoplasma gondii, Leishmania spp., Giardia spp.

      • Serínové proteázy – trypanozómy, Plasmodium falciparum, Acanthamoeba spp., …

      • Aspartátové proteázy – Apicomplexa

      • Metaloproteázy – Leishmania spp., Trypanosoma cruzi

  • Povrchové proteíny

    • ukotvené v glykokalyxe cytoplazmatickej membrány

      • Lipofosfoglykan – adhézia promastigotov leishmanií k hostiteľskej bunke

      • Proteofosfoglykany – tvorba parazitofórnej vakuoly leishmanií

      • Ďalšie - Glykozilinozitolové fosfolipidy, glykozylované fosfatidylinozitoly

  • Proteíny tepelného šoku (HSPs, chaperony):

    • indukované ako reakcia na nepriaznivé podmienky, obmedzujú poškodenie b., chránia iné proteíny (zastavia bunkový cyklus, denaturáciu proteínov atď.)

Evolučné a behaviorálne adaptácie

  • Reprodukčné stratégie:

    • rozpoznanie a vyhľadanie hostiteľa – závisí od pasívneho šírenia (Entamoeba, Giardia …) alebo od prenosu hematofágnymi vektormi (Trypanosoma, Plasmodium …)

    • enormná produkcia cýst (meňavky, Giardia), oocýst (kokcídie)

  • Patogenita a virulencia:

    • Patogenita = schopnosť parazita narušovať fyziologickú rovnováhu hostiteľa (vzniká ochorenie)

    • Virulencia = stupeň patogenity – je to geneticky daná vlastnosť kmeňa parazita, daná za pre konkrétne podmienky pre určitý druh hostiteľa a jeho fyziologický stav

      • Faktory virulencie:

        1. špecifické adhézne proteíny (adhezíny) a lektíny, ktoré sa nachádzajú na bunkovom povrchu parazita, sú dôležité pre invázne procesy

        2. proteázy, cytotoxické proteíny – napr. amébopór – vylučovaný trofozoitmi Entamoeba histolytica indukuje lýzu buniek, podobne naegleriapór (Naegleria fowleri); enzýmy - hydrolázy, fosforylázy atď.

Imunobiologické interakcie

  • Nešpecifická (vrodená, neadaptívna) imunita

    • nie je viazaná na skúsenosť s infekciou

    • poskytuje len čiastočnú ochranu

    • delí sa na 2 línie:

      • Prvá línia – fyzikálno-chemická bariéra (povrch kože, sliznice DS, TS, UGS) – mechanická prekážka - mucínové sekréty (hlieny) bránia usídleniu parazitov

      • Druhá línia

        1. bunková imunita (lymfocyty, neutrofilné leukocyty, makrofágy, dendritické bunky …) – fagocytóza parazitov

        2. humorálna imunita (alternatívna cesta aktivácie komplementu =zložka komplementu sa viaže na povrch bunky parazita – vedie k lýze bunky parazita) (komplement = skupina proteínov schopná po aktivácii lyzovať patogény)

    • Cytokíny, proteíny a glykoproteíny neprotilátkového charakteru ovplyvňujú imunitné a zápalové reakcie buniek, priťahujú fagocyty na miesto infekcie

      • Cytokíny: napr. interleukíny (IL-1, IL-6, IL-8 a IL-12), faktory nekrotizujúce nádory (TNF-α, TNF-β ) – sprostredkujú komunikáciu imunitných buniek

  • Špecifická (získaná, adaptívna) imunita

    • sprostredkovaná humorálnymi a celulárnymi systémami:

      • B lymfocyty - produkujú protilátky – imunoglobulíny IgG, IgM, IgA a IgE

      • T-lymfocyty – produkujú interleukíny, TNF-α a TNF-β, aktivujú eozinofily a tvorbu IgE

    • chemokíny – proteíny zabezpečujúce chemotaxiu makrofágov, majú aj antiprotozoárny účinok

  • Evázne (únikové) mechanizmy parazitov

    • Funkcia – únik z dosahu obranných reakcií hostiteľa

      • Intracelulárne parazity (Leishmania, Toxoplasma …)

        • útlm acidifikácie parazitofórnej vakuoly

        • modulácia tvorby cytokínov

        • prevencia apoptózy

        • sekvestrácia – adhézia erytrocytov infikovaných Plasmodium falciparum k endotelu kapilár (únik pred imunitnou reakciou)

      • Extracelulárne parazity (napr. Trypanosoma brucei)

        • antigénna variabilita – stratégia úniku pred imunitnou reakciou

Epidemiológia a ekológia protozoárnych infekcií

  • Epidemiológia - vedná disciplína, ktorá skúma prečo, kedy a kde sa choroby vyskytujú, a akými spôsobmi sa prenášajú

  • Infekcia (nákaza) = preniknutie parazita do hostiteľského organizmu + následný proces patologických zmien

  • Vstupná brána infekcie = miesto prieniku parazita do tela hostiteľa (často sliznice, koža, TS, UGS)

  • Ukazovatele výskytu infekcie:

    • Prevalencia (percent infestation, extensity) - počet prípadov v populácii, zväčša v % (objem infikovanosti)

    • Incidencia (attack rate, colonization rate, morbidity rate) – počet prípadov za časovú jednotku, napr. 1 rok (frekvencia)

  • Rozdelenie ochorení podľa výskytu v zemepisnej oblasti – 4 epidemiologické typy:

    • Sporadický – ochorenie ojedinelé, nepravidelne, bez vzťahu jednotlivých prípadov

    • Epidemický – ochorenie vo väčšom počte prípadov (miestne a časovo)

    • Pandemický – ochorenie hromadne vo viacerých oblastiach, dokonca kontinentoch

    • Endemický – ochorenie sa vyskytuje v danej geografickej oblasti trvale. Incidencia a prevalencia sú vo vzájomnej rovnováhe

  • Rozdelenie parazitóz podľa globálneho rozšírenia

    • Geopolitné – vo všetkých klimatických pásmach

    • Tropické – viazané výskytom na trópy

    • Importované – tropické infekcie zavlečené do mierneho pásma

  • Typy šírenia protozoárnych infekcií

    • Priamo

      • Kontaktom slizníc ústnej dutiny – Entamoeba gingivalis, Trichomonas tenax

      • Kontaktom slizníc urogenitálneho traktu – Trichomonas vaginalis

      • Transplacentárne – Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, malária

    • Nepriamo

      • Fekálno-orálne – cystami kontaminovanými potravinami (Entamoeba histolytica, Giardia intestinalis …)

      • Alimentárne – tkanivovými cystami Apicomplexa po ingescii infikovaného tkaniva

      • Inokulačne – transfúzna a transplantačná infekcia (malária, babezióza …)

      • Intrakonjunktiválne – do spojovkového vaku (Acanthamoeba spp.)

      • Inhalačne – vdýchnutie cýst amfizoických meňaviek, spór mikrosporídií

      • Intranasálne – trofozoitmi Naegleria fowleri vo vode

      • Vektorom – cicaním krvi hematofágnym článkonožcom (trypanozomózy, leishmaniózy, malária, babezióza)

  • Šírenie infekcií prostredníctvom vektora

    • Prenos acyklický – pasívnou kontamináciou ústnych orgánov vektora

    • Prenos cyklický – parazit je viazaný časťou životného cyklu na článkonožca (komáre, muchy tse-tse, kliešte, bzdochy…)

  • Zoonóza = infekcia, ktorá sa šíri zo zvierat na človeka

    • V prípade protíst = protozoonóza

  • Ďalšie faktory ovplyvňujúce šírenie protozoárnych infekcií:

    • Geologické, geografické, klimatické, meteorologické …

    • Chemické (voda, vzduch, chemické znečistenie)

    • Hydrologické (vodné telesá, mokrade, močiare)

    • Sociálno ekonomické (poľnohospodárstvo, lesníctvo, ťažba, urbanizácia, migrácia za prácou atď.)

  • Budúcnosť - Molekulárna epidemiológia

    • nový, moderný trend aplikácie molekulárnych analýz v epidemiológii

    • analýza genotypu patogénnych organizmov, rozlíšenie patogénnych a nepatogénnych kmeňov

    • analýza zdrojov infekcií a prevencie reinfekcií

    • výskum dynamiky šírenia v endemických oblastiach

Patológia protozoárnych infekcií

  • Opis morfologických a funkčných zmien, ktoré parazitické protista vyvolávajú v tkanivách a orgánoch hostiteľa

  • Úspešne adaptované parazity (často evolučne „staré“ parazity) sa množia a perzistujú v tele hostiteľa bez vyvolávania závažných patologických porúch

  • Evolučne “mladé“ parazity spôsobujú často závažné poškodenie tkanív, často s fatálnymi následkami pre hostiteľa

  • Postihnutie orgánov a sústav tela hostiteľa

    • Tráviaca sústava

      • nekrotické lézie s následkom dyzentérie – črevná amebóza

      • akútne a chronické hnačky – balantidióza, giardióza (+ malabsorbcia), malaria tropica

      • megaformácie tráviaceho traktu (megacolon) – Chagasova choroba

      • poškodenie mikroklkov a tkanív čreva (+ malabsorbcia) – viscerálna leishmanióza, mikrosporídie

      • rôzne črevné ťažkosti - črevné kokcídie, toxoplazmóza (+ lézie)

    • Cievna sústava, srdce, krv

      • myokarditída – Chagasova choroba v akútnej fáze, viscerálna leishmanióza

      • kardiomegália – Chagasova choroba v chronickej fáze

      • postihnutie perikardu – toxoplazmóza, zriedkavo amebóza (pri ruptúre abscesu pečene)

      • anémia – giardióza, malária (zároveň s trombocytopéniou), babezióza, akútna spavá choroba, viscerálna leishmanióza

    • Hepatopatia a postihnutie žlčovodov

      • zväčšenie pečene – extraintestinálna amebóza (často absces), malária, viscerálna leishmanióza

      • postihnutie žlčníka + ikterus – giardióza (zriedka)

      • hepatitída – mikrosporídie, babezióza

    • Slezina a splenomegália

      • absces – vzácne pri amebóze

      • malarická splenomegália = zväčšenie sleziny s hyperpláziou pri malárii

      • splenomegália – viscerálna leishmanióza, babezióza

    • Lymfadenopatia – postihnutie a zväčšenie lymfatických uzlín

      • kongenitálna toxoplazmóza

      • spavá choroba, viscerálna leishmanióza

    • Pneumopatia

      • absces v pľúcach – systémová komplikácia amebózy

      • pneumónia – zriedkavo pri toxoplazmóze

      • pľúcny edém – malária

      • pľúcne hemorágie – viscerálna leishmanióza

    • Obličky a močové cesty

      • amébový absces v obličke – komplikácia amebózy

      • usídlenie parazita v močovej rúre a prostate – trichomonóza u mužov

      • postihnutie glomerulov – zriedka pri malaria tropica

      • intersticiálna nefritída s mikroabscesmi – pri mikrosporidióze Encephalitozoon hellem

    • Gynekologické ochorenia

      • amébové lézie v oblasti cervix uteri – komplikácia pri amebóze

      • zápal sliznice vagíny – trichomonóza (vzácne aj v uteruse a oviduktoch)

    • Kožné ochorenia

      • kožné ulcerácie – amebóza, akantamebóza

      • kožné a kožno-slizničné lézie pri leishmanózach

      • primárna lézia pri infikovaní Trypanosoma cruzi (Chagasova choroba)

    • Neurologické poruchy

      • mozgový absces – vzácne pri amebóze (metastáza z čreva a pod.)

      • granulomatózna encefalitída (GAE) – akantamebóza, balamuthióza

      • amébová meningoencefalitída – naeglerióza

      • encefalitída s hydrocefalom – kongenitálna toxoplazmóza

      • cerebrálna malária – komplikácia pri malaria tropica

      • poruchy vedomia, spánku, duševné až kóma – spavá choroba

      • neuropsychické poruchy – Chagasova choroba

      • encefalitída, edém mozgu – viscerálna leishmanióza

    • Postihnutie oka

      • keratitída + poškodenie rohovky (ulcerácia, perforácia) – akantamébová keratitída

      • chorioretinitída (zápal dúhovky a sietnice) – kongenitálna toxoplazmóza

      • keratokonjunktivitída – mikrosporidiózy

Metódy výskumu protozoárnych infekcií

  • Základné prístrojové vybavenie parazitologického laboratória

    • prístroje na udržiavanie stálej teploty – inkubátory, chladiace a mraziace boxy

    • prístroje na mechanické operácie a meranie fyzikálnych veličín – centrifúgy, mikrocentrifúgy, ultracentrifúgy, vortex, trepačky, váhy, spektrofotometer, pH meter, mikropipety …

    • filtračné pomôcky na sterilizáciu a purifikáciu – striekačkové filtre …

    • autokláv, sterilizátor ovzdušia v labotratóriu

    • laminárny box (biohazard box)

    • prístroj na destilovanú a redestilovanú vodu

    • chovné nádoby, klietky pre laboratórne zvieratá

    • prístroje na sérologické testy

    • prístroje na molekulárne analýzy

    • svetelný mikroskop (+ špeciálne mikroskopické techniky - diferenciálny interferenčný kontrast, fázový kontrast, fluorescenčná mikroskopia)

    • konfokálna laserová mikroskopia – záznam a skladanie optických rezov pozdĺž optickej osi mikroskopu

    • elektrónová mikroskopia (SEM, TEM)

  • Základné vyšetrovacie metódy

    • I. Priamy dôkaz parazita - mikroskopicky

      • preparáty

        • Natívny preparát - cerebrospinálna tekutina (Naegleria fowleri) bronchoalveolárna laváž (Toxoplasma, …) preparát čerstvej stolice (Giardia, …) kultúra (akantaméby, trypanozómy, …)

        • Trvalý preparát: krvný rozter (Plasmodium spp. …) histologické preparáty (preparáty napadnutých tkanív) farbenie: Giemsa-Romanowski, Haematoxylin+Eozin, Gömöriho trichrom …

      • koprologické metódy - dôkaz črevných parazitov (entaméby, žardie, …)

        • natívny preparát čerstvej stolice – pohybujúce sa trofozoity

        • jódovaný preparát – stolica + Lugolov roztok – trofozoity

        • koncentračné metódy (cysty, oocysty, spóry) – sedimentačné – v sedimente - flotačné – na povrchu suspenzie

      • Centrifugáciou suspenzie krvi a Percoll-u (častice koloidného kremíku) sa parazitované erytrocyty koncentrujú v spodnej časti skúmavky

      • kultivačné metódy

        • kultivácia parazitických protíst na umelých médiách za účelom identifikácie a ďalšieho výskumu

        • Kultivačné médiá: Balamuthovo jednofázové vaječné médium (Entamoeba, Balantidium) Dobellovo-Laidlawovo sérové médium (Entamoeba) Sérové médium STS (Trichomonas vaginalis) PYG (Acanthamoeba) RPMI (Leishmania) Nelsonovo médium (Naegleria fowleri) Tkanivové kultúry (MDCK, HeLa, …)

    • II. Nepriamy dôkaz parazita

      • Detekcia protilátok alebo antigénov

        • Imunodiagnostické metódy

          • nepriama imunofluorescenčná reakcia (NFR/IFAT) - v prípade pozitívnej reakcie - naviazanie antigénu + konjugovanej protilátky (s naviazaným fluorochromom) na protilátky v testovanom sére

          • enzýmová imunoanalýza (ELISA, enzyme-linked immunoabsorbent assay) – detekcia protilátok (napr. IgG) alebo antigénu reakcia sa hodnotí podľa farebnej zmeny (enzymatický rozklad substrátu)

          • nepriama hemaglutinačná reakcia (NHR) – na skríningové analýzy v prípade pozitívnej reakcie (prítomnosť protilátok v sére) – vznik zhluku erytrocytov (s umelo naviazaným antigénom), pri negatívnej reakcii sa nezhlukujú a postupne sedimentujú na dno mikrotitračnej platne

          • imunohistochemické testy – aplikácia imunologických metód v histologických cytologických analýzach

          • molekulárne metódy

            • Polymerázová reťazová reakcia (PCR) –