Streptomyces Signaling

Marta Mendes - High GC gram+ (Actinomycetota)

Streptomyces - cheiro a terra molhada

Como as bactérias sentem os seus arredores:

• Sinal - Receptor pode ser de membrana, se for de fora - tradução sinal - resposta celular.

1. Mecanismos principais:

• Fatores Sigma

• Sistemas de dois componentes

• Sistemas de um componente (simplificação do anterior ou FT isolados)

  
  

1.1 Fatores Sigma

• Ativados por um fator anti-sigma associado à membrana.

• O reconhecimento do promotor no DNA e iniciação da transcripção é dependente do fator sigma.

• Um componente: receptor e efetor.

• Componentes RNA polimerase:

  • A enzima core é composta por 5 subunidades e a holoenzima inclui o sigma.

  • A enzima core pode ter atividade catalítica de transcrição de RNA e só se inicia com a presença do sigma, que se dissocia dependendo da necessidade de transcrição.

  • Sigma - reconhecimento da zona promotora e iniciação da transcrição.

Na célula, existe uma pool de fatores sigma que correspondem a estímulos diferentes. Mediante o sinal, recruta RNA polimerase para a zona promotora do gene, promove a transcrição e criação do RNA e depois dissocia-se do complexo, com libertação do RNA.

• Estruturalmente, são baseados na homologia com dois sigmas da E. coli.

• O fator sigma principal é o sigma70 (vamos falar destes), os 54 são estruturados de forma diferente e reconhecem zonas promotoras de forma diferente.

• Os sigma70 são mais importantes e abundantes. São os mais produzidos durante o crescimento

• Os sigma54 são produzidos mais em respostas ambientais, necessitam de uso de ATP

1.2 Organização do fator sigma

• 4 domínios principais:

  • Domínios essenciais: 2 e 4 (reconhecidos pelos -10 e -35 no DNA da bactéria). O domínio 2 reconhece o -10 e o sigma 4 o -35.

  • 2 - inicia o processo de transcrição promovendo a "DNA melting" - separação das cadeias de DNA. E ligação ao Core.

  • 1 - atividade de autoinibição - proibir a ligação a zonas promotoras sem estar ligado à RNA pol.

  • 3 - estabilização do complexo de iniciação (RNA pol + DNA). Reconhecimento -10

Familia sigma70

• Grupo 1 - fatores sigma housekeeping:

  • 1 gene por bactéria com todos os domínios - glicólise no controle destes fatores sigma.

• Grupos 2, 3 e 4:

  • Grupo 2: tem os 4 domínios muito parecidos com os 1, mas são responsáveis por genes não essenciais. Estruturais

  • Grupo 3: fatores sigmas relacionados com desenvolvimento e estresse, pouco abundantes, não têm domínio 1.

  • Grupo 4: muito abundantes, comandam quase toda a resposta da bactéria aos estímulos, ECFs. Extracitoplasmaticos

• ECFs número por bactéria varia muito. Está relacionado com a agilidade da resposta da bactéria, há pelo menos 157 catalogados.

2. Função e caracterização de fatores sigma

Concentração e afinidade para RNA pol.

• A concentração dos fatores sigma: se não estiverem disponíveis, é uma forma de controlo. Os housekeeping têm mais afinidade que os outros devido à quantidade de contatos.

• É feito por proteínas fatores anti-sigma - ligam-se ao sigma e impedem disponibilidade à RNA pol. O caso mais típico é uma proteína de membrana que, na sua parte citoplasmática, se liga ao sigma e sequestra-o.

• Ocorrendo estresse/sinal, o anti-sigma liberta o sigma, que fica disponível para atuar.

2.1 Quebra de ligação anti-sigma a sigma:

• Proteólise regulada de anti-sigma (degradação do anti-sigma), libertação de sigma.

• Modificação estrutural da proteína, estresse oxidativo (proteína sensível a alterações reduz com mudança conformacional e liberta sigma).

• Mudança de parceiro. Reconhecimento do sinal com outra proteína que tenha mais afinidade com o anti-sigma do que o sigma - fatores anti-anti sigma.

3. Exemplo prático experimental do papel deste tipo de proteínas: Streptomyces

• Gram positivas.

• Actinomicetales.

• No geral, não são patogênicos (scabis).

• Implicados em processos de composição do solo.

• 50% metabolitos secundários são bioativos

• Ciclo de vida complexo

• Potencial de compostos de atividade biológica relevante para nós, como antibióticos para tuberculose:

  • Eritromicina.

  • Tacrolimus (imunossupressor).

4. Metabolismo primário e secundário

• Primário - essencial.

• Secundário - não essencial, mas ocorre em determinadas condições.

• 45% dos metabolitos secundários de interesse são produzidos por bacterias, em que 78% desses são por streptomyces

5. Ciclo de vida

• Desenvolvimento com duas fases:

  • Crescimento domiciliar e aéreo.

  • Formam esporos.

  • Germinação do esporo, tubo germinativo com micélio vegetativo, diferenciação morfológica e formam-se esporos em hifas.

• Cinzento - esporulação.

• O azul escuro e vermelho é a produção de metabolitos secundários.

• (BldD) - na presença de GMP cíclico, ficam unidas e inibem a produção dos genes. Varia; quando os níveis são baixos, desencadeia-se a diferenciação e a transcrição dos genes.

5.1 Fatores Sigma

• Inibido por BldD, mas também o anti-sigma.

• Inibe a RNA pol ao ligar-se ao DNA.

• No crescimento vegetativo é focado nos primários; na fase aérea, há menos GMP cíclico e a transcrição de genes para a fase aérea e a esporulação.

• Sigma BldN - forma casaco hidrofóbico das hifas.

• Sem BldD, o sigma e anti-sigma são transcritos. Somente a meio da diferenciação aérea um sinal é reconhecido pelo anti-sigma que liberta o sigma que vai transcrever proteínas para formar o casaco aéreo - permite uma transcrição temporal.

6. Sistemas de dois componentes

• Reconhecimento de sinal e resposta de sinal - sistema tranferencia de fosforo His-Asp (TCS)

• Sistemas que as bactérias utilizam para ambientar-se a estímulos ambientais envolvidos em numerosas respostas celulares.

• TCS Típico: histidina cinase (SK) ancorada na membrana que atua como sensor e fosforila uma segunda proteína responsável a desencadear a resposta (Com uso de ATP).

• Autofosforiliza-se na histidina e transfere para o residuo de aspartato da proteína seguinte de resposta (efetora?).

• TCS tem duas proteinas homodimericos com multiplos domínios

• SK - Sensor cinase

• HK - domínio de sensação de sinal

• RR - regulador

SK

• Dominio variavel - N terminal, recebe

• Dominio conservado - Cataliza a fosforilação His, transmite

RR

• Dominio conservado - Recebe, N-terminal (Asp)

• Domínio variavel - Variavel C-terminal

• Sistema de estado redox - domínio PAS, domínio transmissor com a histidina, um com aspartato para transmitir; o outro tem só um domínio aspartato.

• Arquitetura típica ancorada à membrana com domínio que vai sentir o input que vai transferir um fosfato como segunda proteína que vai receber o sinal e tem uma segunda domínio de atividade com ligação ao DNA.

  • Algumas proteinas pois temos híbridas em que se juntaram as duas proteínas que se formam só uma proteina com todos os componentes.

Só se unem os domínios conservados das proteínas com capacidade de sentir e ter uma atividade - atividade de cinase dentro da própria proteína.

7. Domínio de sensor da cinase

• São muito variáveis devido ao estímulo que é sentido:

  • Sensor transmembranar

  • Um domínio que se destaca, domínio PAS, capazes de sentir, mas identificar o ligando ou o sinal exato é difícil.

Domínios conservados

• Transmissor cinase:

  • Autofosforilação para a histidina.

  • Atividade de fosforilização do RR

  • Atividade de fosfatase - desfosforiliza-se a si própria - regula a própria atividade.

  • Também pode ser desativado por outra proteína, mas tem o controlo da própria atividade.

  • Dimeração de histidina phosphotransfer

  • Domínio catalítico de fosfotransferase e fosfatase.

Domínio recetor

• Fosforilado num residuo de aspartato conservado.

• Tem 5 beta sheets e 5 hélices alfa com a principal função como mediador de sinal.

• O aspartato fosforilado faz alterar a conformação da proteína de resposta.

• Necessário de cofatores de magnésio ou manganês para a atividade funcional.

• Faz com que o domínio de output seja induzido.

• Catião 2+ é necessário para a fosforilação/desfosforilação, como Mg2+ e Mn2+

Output

• Mais comum dos casos é um domínio de ligação ao DNA para ativar a transcrição ou bloquear.

• Atividade enzimática.

• Ligação ao RNA.

• Ligações de domínios a outras proteínas com possível interação com sigmas ou anti-anti sigmas.

Cianobactérias têm mais sistemas de dois componentes do que sigmas.

Fosfato inorgânico (PO₄³⁻)

• Essencial em basicamente tudo.

• Regulação de fosfato inorgânico é essencial para a bactéria, feita na bactéria por sistemas de dois componentes.

• Cinase sensora PhoR, um PhoB para resposta.

• Sistema de transportador de fosfato e PhoU para ligação entre o transportador e PhoR.

• Em condições baixas de fosfato, o sistema é ativo; quando há concentração de fosfato normal, o sistema desliga-se.

Streptomyces coelicolor

• Pigmento azul com baixa atividade antibiótica - actinorhodina.

• Todos os genes responsáveis pela síntese do composto - actinorhodin biosynthetic gene cluster.

• Vemos uma curva de crescimento a várias concentrações de fosfato:

  • A produção de actinorhodina é maior a menor concentração de fosfato.

  • Metabolitos secundários ocorrem numa fase posterior, também vemos a nível molecular na transcrição de genes.

  • O fosfato inibe a produção de Actinorhodin

  • O fosfato retarda a produção de Actinorhodin

  • A produção de Actinorhodin é provocada pela depleção de fosfato

• PhoRP estão relacionados com a captação de fosfato e regulam também a expressão de compostos secundários. Se tem condições ótimas de crescimento, não vai produzir compostos secundários.

• PhoP tem dois domínios, o receptor conservado e um domínio regulador de resposta com atividade de ligação ao DNA.

• O PhoP liga-se ao DNA para inibir a transcrição? - ChIP-seq: pegamos na proteína, induzimos a ligação, desfazemos o DNA com a proteína ligada e codificamos os fragmentos que ficaram ligados à proteína, codificando todos os motivos e genes ativados.

• PhoP ativa e reprime certos genes:

  • Procura adicional de fosfato e biossíntese de parede (quando não há fosfato).

  • Repressão de assimilação de nitrogênio, metabolismo de glicólise, etc

  ChIP-seq overview: Esta técnica é usada para identificar as regiões do genoma com que as proteínas se ligam, permitindo entender melhor as interações entre o sinalizador PhoP e os elementos regulatórios associados aos genes alvo.

8. Aplicação biotecnológica

• São sistemas modelares adaptados a estratégias de biosíntese.

• Em um sistema de dois componentes para identificar novos peptídeos antimicrobianos antibióticos que ataquem a parede celular.

• CESR – cell envelope stress response: Todas as bacterias têm uma forma de responder ao estresse induzido na parede celular que difere entre Gram + e -.

  • Respostas diferentes nas duas paredes de acordo com o tipo de parede.

  • Antibióticos têm como alvo a parede celular.

• Bacilos têm respostas aos antibióticos. O que repararam é que o sistema de dois componentes era induzido na maioria dos antibióticos submetidos nas células.

• Aproveitando o sistema LiaSR, temos o LiaS que, com o estímulo, vai autofosforilar e fosforilar o LiaR que vai ativar outros.

• O promotor Plial:

  • Especificidade da perceção do estimulo

  • Maior regulação (baixa leakiness)

  • Comportamento dose-resposta dinâmico

• Com base neste sistema muito específico (quando em causa a parede celular) tight regulation e tem resposta dependente da dose.

• Com base nisso, introduziu-se o sistema numa bactéria teste para ativar o gene reporter emissor de fluorescência.

• Os que têm fluorescência estão a produzir peptídeos que atacam a parede celular.