Molekulární biologie imunitního systému
Imunitní systém
Úvod do Imunitního Systému
Imunitní systém je adaptační a regulační soustava, která spolu s endokrinní a nervovou soustavou udržuje integritu organismu a zajišťuje jeho vitální funkce (homeostázu).
Hlavní funkce:
Obranyschopnost: Rozpoznání cizorodých komponent a ochrana proti patogenním mikroorganismům a toxinům.
Autotolerance: Rozpoznání vlastních buněk a tkání a udržování tolerance.
Imunitní dohled: Rozpoznání a eliminace disfunkčních složek organismu (poškozené, infikované nebo mrtvé buňky).
Funkce Imunitního Systému
Tolerance: Udržování tolerance vůči vlastním zdravým buňkám a neškodným cizím látkám.
Eliminace (Imunitní Dohled): Odstraňování vlastních patologicky změněných nebo zestárlých buněk.
Obranyschopnost: Eliminace cizích infekčních mikroorganismů a parazitů.
Imunitní systém rozpoznává cíle na základě povrchových antigenů.
Imunogenita a Imunogeny
Imunogenita: Schopnost vyvolat imunitní reakci.
Imunogen: Látka, která indukuje imunitní odpověď.
Antigeny, Epitopy a Hapteny
Antigen (Ag): Jakákoliv látka schopná vyvolat imunitní odpověď.
Epitop: Část antigenu rozpoznávaná imunitními receptory.
Hapten: Látka o nízké molekulové hmotnosti, která vyvolá imunitní odpověď pouze po navázání na látku s vyšší molekulovou hmotností (např. bílkovinu).
Druhy Imunitních Mechanizmů (Obratlovci)
Nespecifické (Přirozené, Vrozené, Neadaptivní)
Evolučně starší, přítomny u všech mnohobuněčných organismů.
Nemají imunologickou paměť.
Rozpoznávají strukturní a funkční rysy společné mnoha patogenům.
Okamžitá, rychlá odpověď.
Buněčná složka: Fagocytující buňky a přirozeně cytotoxické buňky.
Humorální složka: Komplement, interferony, lektiny a další sérové proteiny.
Přirozené Ochranné Bariéry Neimunitní Povahy
Mechanické: Kůže, sliznice, pohyb řasinek, longitudinální tok vzduchu a tekutin.
Chemické: Mastné kyseliny, lysozym (slzy, sliny), pepsin (žaludek), kyselé pH (žaludeční šťávy, moč), defensiny.
Mikrobiální: Nepatogenní mikroflóra soutěží s patogeny o živiny a receptory, produkuje antibakteriální látky (mikrobiom).
Specifické (Adaptivní) Mechanizmy
Evolučně mladší (obratlovci).
Antigenně specifické (protilátky a receptory).
Efektorové funkce aktivovány až po setkání s antigenem → pomalá odpověď (dny, týdny).
Mají imunologickou paměť.
Humorální: Protilátky (B-buňky/lymfocyty).
Buněčná: Antigenně specifické receptory (T-buňky/lymfocyty).
Rychlost Imunitní Odpovědi
Nespecifická (vrozená) imunitní reakce probíhá v řádu hodin.
Specifická (adaptivní, získaná) imunitní reakce probíhá v řádu dnů.
Prvotní fáze imunitní odpovědi vs. pozdější fáze (likvidace infekce).
Orgány a Tkáne Imunitního Systému
Primární lymfatické orgány: Tvorba a dozrávání imunitních buněk (kostní dřeň, thymus/brzlík, Fabriciova burza u ptáků).
Sekundární (periferní) lymfatické orgány a tkáně: Transport a prostředí pro imunitní buňky, kontakt s antigenem (nebo APC - antigen presenting cells).
Slezina, lymfatické uzliny, tonzily, Peyerovy pláty (střevní sliznice), MALT (mucous associated lymphoid tissue).
Diferenciace Leukocytů z Kmenové Buňky
Kmenová buňka se diferencuje na myeloidní a lymfoidní progenitor.
Myeloidní progenitor: Megakaryocyt (trombocyty), erythroblast (erythrocyt), dendritická buňka, monocyt (makrofág), neutrofil, eosinofil, basofil, mastocyt.
Lymfoidní progenitor: NK buňka, pre-T (Tc/CD8+, Th/CD4+), pre-B (B1, B2).
Efektorové buňky: NK buňka, Tc (CD8+), Th (CD4+), B lymfocyty (plazmocyty).
B-lymfocyty
Tvoří se v kostní dřeni (a játrech fétu).
Povrchový imunoglobulin (receptor pro antigen).
Vazba antigenu → diferenciace na plazmatické buňky (produkují protilátky) a paměťové buňky.
Protilátky jsou rozpustné formy B-buněčných receptorů pro antigen.
T-lymfocyty
Tvoří se v thymu (brzlík).
Rozpoznávají antigen pouze na povrchu APC (makrofág, B-lymfocyt, dendritická buňka, infikovaná buňka).
Typy: Cytotoxické Tc (CD8+) – usmrcují infikované buňky, pomocné Th (Th1 aktivují makrofágy, Th2 aktivují B-lymfocyty), paměťové T-lymfocyty.
Klonální Systém Aktivace B-lymfocytů
Naivní lymfocyty se aktivují antigenem a 2. signálem.
Dochází k diferenciaci a genové rekombinaci.
Vznikají paměťové buňky a zralé efektorové buňky.
Vývoj B- a T-lymfocytů
Bursa Fabricii (u ptáků) / kostní dřeň → tvorba protilátek (imunoglobulinů, Ab).
Thymus (brzlík) → sekundární lymfatické orgány → reakce lymfocytů s antigeny a jejich aktivace.
Diferenciace B-lymfocytů
Kmenová buňka → pre-B-lymfocyt (přeskupení subgenů pro H-řetězec, vznik IgM-cytoplazmatického).
Nezralé B-lymfocyty (přeskupení subgenů pro L-řetězec, vznik IgM-membránového).
Zralé B-lymfocyty (první přesmyk tříd IgM - IgD, membránových).
Plazmatické a paměťové buňky (+ antigen = primární/sekundární odpověď).
Vysoká tvorba IgA, IgE, IgG, změny v genech pro tvorbu protilátek.
Vývoj B-lymfocytů (1)
Prekurzory vznikají dělením pluripotentní hematopoetické kmenové buňky v kostní dřeni.
Dochází k V(D)J rekombinaci (přeskupování genových segmentů těžkých a lehkých řetězců za účasti RAG1 a RAG2).
Nezralé B lymfocyty exprimují receptor a prodělávají selekční procesy (testování autoimunity a schopnosti přežití).
Vývoj B-lymfocytů (2)
Naivní B buňky jsou vyplavovány do krve a do periferních lymfatických orgánů, kde se setkávají s antigeny.
Po aktivaci proliferují, tvoří germinální centra, kde probíhají somatické hypermutace (SHM) a izotypové přepnutí (CSR).
Přeměna na plazmatickou buňku (v kostní dřeni) produkující protilátku a paměťovou buňku.
Protilátky - Imunoglobuliny
Glykoproteiny produkované jako odpověď na stimulaci imunogenem; reagují in vitro i in vivo specificky a selektivně s antigeny.
Syntetizovány a vylučovány plazmatickými buňkami (diferencované B-lymfocyty).
Struktura Imunoglobulinů
Čtyři polypeptidy: dva identické těžké (H) řetězce (asi 440 AA) a dva identické lehké (L) řetězce (asi 220 AA) spojené disulfidickými vazbami.
Konstantní oblast (C: CH a CL) s relativně neměnnou sekvencí AA a variabilní oblast (V: VH a VL) lišící se mezi imunoglobuliny.
Lehké řetězce mají 1 konstantní oblast, těžké 3 nebo 4. Variabilní oblast je složena ze tří hypervariabilních úseků (5-10 AA) a čtyř méně proměnlivých úseků.
Hypervariabilní oblasti tvoří vazebné místo pro antigen.
Imunoglobuliny jsou na těžkých řetězcích glykozylovány.
Část konstantní oblasti těžkého řetězce je flexibilní (pantová oblast).
V pantové oblasti lze molekuly enzymaticky rozštěpit na Fab (antigen vázající) a Fc (krystalizující) fragmenty.
Avidita: Síla interakce mezi antigenem a protilátkou.
Charakter vazeb mezi antigenem a protilátkou: iontové interakce, hydrofobní interakce, van der Waalsovy síly, vodíkové můstky.
Oblasti Hypervariability
HV = hypervariabilní oblast, FR = framework regions (méně proměnlivé úseky).
Každá hypervariabilní oblast má jen 5 až 10 AA účastnících se vazby antigenu.
Vazebné místo pro antigen vzniká sekundárním a terciárním uspořádáním hypervariabilních oblastí.
Klasifikace Imunoglobulinů
Podle typu těžkých řetězců: IgA, IgG, IgD, IgE, IgM.
Struktura krystalizujícího fragmentu Fc ovlivňuje interakci s bílými krvinkami a proteiny komplementu.
Jedna plazmatická buňka může produkovat více tříd imunoglobulinů, ale všechny jsou specifické pro stejný antigen (stejná variabilní oblast).
Komplement: Systém sérových proteinů aktivovaných komplexy protilátka-antigen nebo mikroorganismy; pomáhá eliminovat patogenní mikroorganismy.
Klasifikace Ig a Jejich Funkce
IgM (µ): Aktivuje komplement (5%).
IgD (δ): Uvolňování histaminu, alergie (1%).
IgG (γ): Aktivuje komplement (80%).
IgA (α): Součást slin a sekretů (14%).
IgE (ε): Alergické reakce (<1%).
Jako první se tvoří IgM, který se pak může přeměnit na další typ při zachování specificity pro antigen.
Počet Protilátek
Člověk má ~ různých protilátek (100 000 000 000).
Klasifikace Imunoglobulinových Řetězců
Řetězce jsou kódovány 3 geny (komplexy) na různých chromozomech.
IgH (těžký řetězec) na chromozomu 14.
IgL (lehké řetězce λ a κ) na chromozomech 2 a 22.
Lehké řetězce: VLCL (VκCκ nebo VλCλ).
Těžké řetězce: VHCH (VHCµ, VHCγ, VHCα, VHCδ, VHCε).
Subgeny a Uspořádání
Geny pro těžké a lehké řetězce se skládají z genových segmentů (V, D, J, C).
V, D a J jsou zodpovědné za strukturu variabilní oblasti.
C (3-4 u těžkého, 1 u lehkého) tvoří konstantní část.
Subgeny pro lehké řetězce: L-VJC.
Subgeny pro těžké řetězce: L-VDJC.
Přehled uspořádání lidských genů kódujících Ig řetězce.
Procesy Upravující Geny pro Protilátky
Změny na úrovni DNA (přeskupování subgenů pro variabilní/konstantní oblasti).
Změny na úrovni transkripce (alternativní sestřih, zakončení transkripce).
Přechod membránově vázané formy na sekretovanou.
Přechod IgM na IgG.
Aktivace/inaktivace rodičovských genů, alelická exkluze.
Přeskupování Subgenů
Během zrání B lymfocytů dochází k V(D)J rekombinaci.
Z každého segmentu je náhodně vybrána jedna varianta.
Každý B-lymfocyt obsahuje jeden přeskupený gen pro lehký a jeden pro těžký řetězec.
V(D)J rekombinace je náhodný proces.
Mechanismus Rekombinace
V(D)JC rekombinace je založena na rekombinačních signálních sekvencích (RSS).
Struktura RSS: Heptamer (5´-CACAGTG-3´) a nonamer (5´-ACAAAAACC-3´) oddělené mezerníkem (12 nebo 23 bp).
Konce subgenů (V, J, C) jsou vymezeny těmito sekvencemi nebo komplementárními sekvencemi.
RAG-1 a RAG-2
Recombination activating gene-1, -2.
Místně specifické rekombinázy, které identifikují RSS.
RAG-1 rozpoznává nonamerovou část, RAG-2 heptamerovou.
Normálně přítomny v nezralých T- a B-lymfocytech.
RSS a Pravidlo 12/23
Signální sekvence s mezerníkem 12 se může spojit pouze se sekvencemi s mezerníkem 23, čímž je zajištěno správné spojení V, D a J segmentů.
Rekombinázový Komplex
Tvořen proteiny RAG1 a RAG2.
Rozpoznává RSS a štěpí DNA → vytváří dvouřetězcové zlomy.
Heptamery se přikládají k heptamerům a nonamery k nonamerům.
Nepřesná Spojení
Vytvoření smyčky, vyštěpení, spojení konců D a J terminální transferázou, DNA-polymerázou a ligázou → krátké náhodné sekvence.
Produktivní a Neproduktivní Spojení
Inzerce nukleotidů může způsobit posun čtecího rámce (neproduktivní spojení).
Alelická Exkluze
Pokud je přeskupení produktivní, je další přeskupování na druhém chromozomu zastaveno → každý B-lymfocyt produkuje jen jeden H a L řetězec (kódovaný jen jedním chromozomem).
Izotypový Přesmyk / Přepnutí
Změna třídy Ig (těžkých řetězců).
Variabilní oblast H řetězce zůstává zachována, mění se konstantní oblast.
A. Přesmyk na úrovni transkripce (úprava mRNA) – přechod z membránového IgM na sekretovaný IgM.
B. Přesmyk na úrovni DNA – vytvořený exon L-VDJH se připojuje k různým subgenům C po deleci sekvence mezi J a některými C (řízen signály přesmyku S).
Charakteristika Izotypů
IgG: opsonizace, neutralizace, přestupuje placentu, sekundární odpověď.
IgA: ochrana sliznic, opsonizace.
IgM: aktivace komplementu, primární odpověď, receptor pro antigen.
IgD: receptor pro antigen.
IgE: ochrana proti parazitům.
Formy Protilátek
Povrchové (transmembránové, BCR-receptor) – receptor pro antigeny, přenos signálu.
Sekretované – produkované plazmatickou buňkou, uvolňované do prostředí.
Sekretované a Membránové Ig
Membránově vázané mají transmembránovou hydrofobní doménu.
Sekretované formy mají hydrofilní aminokyseliny.
Alternativním sestřihem se určí, který exon se uplatní.
Tvorba Těžkých Řetězců Třídy IgM a IgD
Subgeny V(D)J se přeskupují s Cµ → tvorba IgM (povrchový receptor pro antigen).
Cµ a Cδ jsou první subgeny v pořadí C-subgenů těžkých řetězců.
geny kódující těžké řetězce µ povrchového a sekretovaného IgM a gen kódující těžký řetězec povrchového IgD se nacházejí v transkripčních jednotkách, které se vzájemně překrývají, jsou přepisovány ze stejného promotoru a končí při různých terminátorech.
Tvorba Těžkých Řetězců Třídy IgM a IgD
V sestavě subgenů těžkých řetězců jsou v pořadí C-subgenů jako první subgeny Cµ a Cδ.
geny kódující těžké řetězce µ povrchového a sekretovaného IgM a gen kódující těžký řetězec povrchového IgD se nacházejí v transkripčních jednotkách, které se vzájemně překrývají, jsou přepisovány ze stejného promotoru a končí při různých terminátorech.
Průběh seskupování subgenů a alternativní sestřih hnRNA u těžkých řetězců
Změny na úrovni transkripce.
Koexprese IgM a IgD regulovaná úpravou transkriptu
Přesmyk Imunoglobulinových Tříd (na úrovni DNA)
Přechod z jedné třídy Ig do druhé při diferenciaci (stejná variabilní oblast H a L řetězce, odlišná konstantní oblast).
Probíhá po skončení V(D)J rekombinace a po stimulaci antigenem.
Řízen signály přesmyku (S) na 5´-konci CH-subgenů.
Signály Přesmyku – Přepínací S Oblasti (switch regions)
Přepnutí se uskutečňuje speciální nehomologickou rekombinací DNA.
S oblasti leží v intronu mezi JH segmentem a genovým segmentem C a dále v předpolích každého individuálního C-genového segmentu, kódujícího jednotlivé třídy a podtřídy imunoglobulinů.
Každé izotypové přepnutí je produktivní
Schéma izotypového přesmyku při diferenciaci B-lymfocytů
Další fakta o izotypovém přesmyku při diferenciaci B-lymfocytů
při každé rekombinaci je příslušná část konstantní oblasti odstraněna z genomu například B-buňka sekretující IgE už nikdy nemůže přesmyknout na IgM, IgD, IgG nebo IgA!! .
Časový Průběh Vytváření Těžkých a Lehkých Ig Řetězců
(1) Nejdříve se vytvoří těžký řetězec typu µ (pokusy o přeskupení u obou alel …).
(2) Zatím není vytvořen lehký řetězec - těžký řetězec se páruje s tzv. náhradním L- řetězcem (L), složeným ze dvou malých proteinů, a objevuje se na buněčném povrchu: vzniká pre-B lymfocyt.
(3) To je signálem pro zahájení přeskupování subgenů pro L- řetězec.
(4) Nejdříve se začnou přeskupovat subgeny pro L řetězec typu ; pokud vznikne funkční L řetězec, zastaví se přeskupování druhé alely ; pokud ne, začnou se obdobně přeskupovat alely ; pokud se to nepodaří a nebo se vytvoří L řetězec, který se nemůže spojit s H řetězcem, pre-B lymfocyt zaniká; expresí povrchového IgM se buňka stává nezralým B-lymfocytem.
(5) V dalším vývojovém stadiu dochází k současné expresi povrchového IgM a IgD, tím se z buňky stává zralý B-lymfocyt.
poměr molekul protilátek nesoucích řetězec a přibližně - 2:1
po styku zralého B-lymfocytu s antigenem se iniciuje vznik somatických hypermutací a k selekci variant s vysokou afinitou k antigenu a dochází k izotypovému přepnutí
Somatické Hypermutace (SHM) – Afinitní Maturace
Mutace variabilních částí genů, které zvyšují afinitu protilátky k antigenu.
Probíhají současně s izotypovým přesmykem.
Iniciovány enzymem AID (AICDA - activation-induced cytidine deaminase).
AID v jádře interaguje s jednořetězcovými zlomy DNA a ve variabilních oblastech katalyzuje přeměnu dC na dU.
uracyl nepatří mezi báze, které se vyskytují v DNA, a je proto následně opravován opravnými mechanismy; ty nejsou přesné, proto dochází k širokému spektru změn..
Shrnutí: Zdroje Rozmanitosti Protilátek
Přeskupování V-D-J-subgenů – somatická rekombinace, náhodné spojování V, D a J.
Nepřesná spojení V-J (V-D-J) – delece, inzerce, reparace v místech spojování subgenů.
Kombinace lehkých a těžkých řetězců – náhodný proces.
Somatické hypermutace v oblastech V – vysoká frekvence mutací po styku zralého B-lymfocytu s antigenem.
Interakce imunoglobulinů s antigeny
Mechanismus opsonizace
Zastoupení jednotlivých Ig
Alelická a izotypová exkluze
alelická exkluze: během vývoje B-buňky je aktivována pouze 1 alela pro těžký řetězec a jedna alela pro lehký řetězec (tedy vždy alela jen jednoho z rodičů)
izotypová exkluze: z lehkých řetězců je aktivován pouze jeden z možných typů - lambda nebo kappa
výsledná buňka tvoří protilátku obsahující jedinečné vazebné místo pro antigen monospecifická protilátka