Klinička mikrobiologija: Sveobuhvatna skripta za studij

Opća bakteriologija: Građa, metabolizam, genetika i virulencija

• Definicija i podjela mikrobiologije

  • Mikrobiologija se dijeli na dvije osnovne grane:

    • Osnovna (istraživačka) mikrobiologija

    • Primijenjena mikrobiologija

  • Primijenjena medicinska mikrobiologija obuhvaća širok spektar područja:

    • Imunologiju

    • Epidemiologiju

    • Etiologiju

    • Dijagnostiku, prevenciju, kontrolu i liječenje infekcija.

  • Podjela prema vrsti organizma koji se proučava:

    • Bakteriologija (bakterije)

    • Mikologija (gljive)

    • Parazitologija (paraziti)

    • Virusologija (virusi)

  • Podjela prema procesima koji se proučavaju:

    • Mikrobni metabolizam

    • Mikrobna genetika

    • Mikrobna ekologija

• Povijest mikrobiologije: Ključne ličnosti i otkrića

  • Antonie van Leeuwenhoek ($1632.$–$1723.$): Konstruirao leće s povećanjem do $300\times$. On je prvi promatrao mikroorganizme koje je nazvao "animalcula". Godine $1676.$ objavio je prvi opis bakterija.

  • Robert Hooke ($1665.$–$1703.$): Usavršio je mikroskop s dvije leće i uveo termin "stanica".

  • Louis Pasteur ($1822.$–$1895.$): Dokazao je da nema spontane generacije. Razvio je metodu pasterizacije (uništavanje mikroorganizama toplinom). Definirao je fermentaciju kao "život bez kisika". Razvio je vakcinu protiv bjesnoće.

  • Robert Koch ($1843.$–$1910.$): Omogućio porast bakterija u čistoj kulturi i prvi koristio krute podloge (želatina, agar). Identificirao je uzročnika antraksa. Definirao je Kochove postulate, koji služe kao eksperimentalni dokaz povezanosti uzročnika i bolesti.

  • Joseph Lister ($1867.$): Uveo primjenu asepse u kirurškim zahvatima.

  • Edward Jenner ($1798.$): Razvio prvo cjepivo (protiv velikih boginja koristeći kravlje boginje).

• Povijest i razvoj antibiotika

  • P. Ehrlich ($1910.$): Otkrio derivat arsena učinkovit protiv sifilisa.

  • Domagk ($1935.$): Razvio sulfonamide.

  • Alexander Fleming ($1928.$): Otkrio Penicillium notatum (penicilin).

  • Chain i Florey ($1941.$): Omogućili kliničku primjenu penicilina.

  • Povijesni pregled novih klasa:

    • $1950.$-te godine: tetraciklini, kloramfenikol, eritromicin.

    • $1960.$-te godine: ampicilin, cefalosporini $I.$ generacije, aminoglikozidi.

    • $1980.$-te godine: cefalosporini $III.$ generacije, kinoloni.

    • $2000.$ godina: oksazolidinoni (linezolid).

• Suvremene smjernice i izazovi

  • Brza detekcija antigena (primjer: Legionella u urinu).

  • Molekularne metode (PCR, DNA hibridizacija) za detekciju, tipizaciju i identifikaciju.

  • Kontrola bolničkih infekcija.

  • Rezistencija bakterija na antibiotike: Nužno je strogo ograničavanje uporabe antibiotika.

• Klasifikacija mikroorganizama i usporedba karakteristika

  • Skupine uključuju: bakterije, viruse, gljive (kvasci i plijesni), parazite (protozoi i višestanični) i prione.

  • Usporedne osobine:

    • Vidljive u svjetlosnom mikroskopu: Bakterije ($+$), Gljive ($+$), Virusi ($-$), Prioni ($-$).

    • Samostalno umnožavanje: Bakterije ($+$), Gljive ($+$), Virusi ($-$), Prioni ($-$).

    • Prisutni i DNK i RNK: Bakterije ($+$), Gljive ($+$), Virusi ($-$), Prioni ($-$).

    • Kruta stanična stijenka: Bakterije ($+$ *osim mikoplazmi), Gljive ($+$), Virusi ($-$), Prioni ($-$).

    • Osjetljivost na antibiotike: Bakterije ($+$), Gljive ($+$ na antimikotike), Virusi ($-$), Prioni ($-$).

• Građa bakterijske stanice

  • Prokarioti (bakterije): Jezgrina tvar (kromosomska DNA i plazmidi) slobodno je uklopljena u citoplazmi, bez jezgrine membrane.

  • Eukarioti (alge, gljive, biljke, životinje, ljudi): Imaju pravu jezgru i stanične organele (mitohondriji, endoplazmatski retikulum, Golgijev aparat).

  • Osnovni sastojci bakterije:

    • Citoplazma: Sadrži vodu, proteine, enzime, ugljikohidrate, nukleoid, ribosome, plazmide i citoplazmatska zrnca.

    • Stanična ovojnica: Sastoji se od citoplazmatske opne i stanične stijenke.

    • Vanjski dijelovi: Glikokaliks (kapsula), bičevi (flageli), fimbrije (pili).

• Stanična stijenka: Funkcija i sastav

  • Daje stanici čvrst oblik, djeluje kao barijera prema okolini i štiti od osmotske lize.

  • Određuje osjetljivost na antibiotike (propusnost i ciljna mjesta).

  • Nosi antigene i virulentne osobine.

  • Glavni sastojak je peptidoglikan (murein).

  • Razlike prema bojanju po Gramu:

    • Gram-pozitivne: Karakterizira ih debeli sloj peptidoglikana.

    • Gram-negativne: Imaju tanki sloj peptidoglikana i vanjsku membranu koja sadrži lipid A (endotoksin) i O-antigen.

• Faktori virulencije i vanjske strukture

  • Kapsula (glikokaliks): Sastavljena od polisaharida ili peptida. Štiti od fagocitoze, dehidracije i deterdženata. Omogućuje prijanjanje. Prikazuje se pomoću "testa bubrenja kapsule" (Quellung test, npr. kod S. pneumoniae).

  • Flagele (bičevi): Služe za pokretljivost i kemotaksiju.

  • Fimbrije (pili): Služe za prijanjanje (adhezini). Spolni (konjugalni) pili povezuju stanice tijekom procesa konjugacije.

• Bakterijske spore (endospore)

  • Razvijaju se u nepovoljnim uvjetima; izrazito su otporne na temperaturu, isušivanje i kemikalije. Metabolički su inaktivne i infektivne.

  • Uništavaju se isključivo sterilizacijom (autoklaviranje na $121\,^{\circ}\text{C}$ tijekom $15\,\text{min}$).

  • Sporogene bakterije: Clostridium spp. (uzročnici tetanusa i botulizma) i Bacillus spp. (uzročnik antraksa).

  • U povoljnim uvjetima spore germiniraju u vegetativni oblik koji luči toksine i uzrokuje bolest.

• Klasifikacija i morfologija

  • Hijerarhija: Razred – Red – Porodica – Rod – Vrsta.

  • Nomenklatura je binominalna: Rod + vrsta (npr. Escherichia coli).

  • Veličina: Duljina od $0,3$ do $20\,\mu\text{m}$; promjer većine je oko $1\,\mu\text{m}$.

  • Oblici:

    • Koki (kuglaste): Streptokoki (u nizu), pneumokoki (u paru), stafilokoki (u nakupinama).

    • Bacili (štapićaste): Bez spora (enterobakterije, korinebakterije) ili sa sporama (Clostridium, Bacillus).

    • Spirohete (zavojite): Treponema, Leptospira, Borrelia.

    • Zavinuti oblici: Vibrio, Campylobacter.

• Bojanje po Gramu

  • Selektivna metoda za razlikovanje bakterija; brza i jeftina.

  • Gram-pozitivni: Stafilokoki, streptokoki, enterokoki (koki); bacili, klostridiji, korinebakterije, listerije (štapići).

  • Gram-negativni: Neisseria, Moraxella (koki); enterobakterije, Pseudomonas (štapići).

• Metaboličke osobine i rast

  • Odnos prema kisiku:

    • Obligatni aerobi: Trebaju kisik, ne fermentiraju (npr. Pseudomonas). Posjeduju enzime katalazu, peroksidazu i superoksid dismutazu.

    • Fakultativni anaerobi: Koriste kisik ako postoji, ali rastu i bez njega fermentacijom (stafilokoki, enterobakterije).

    • Mikroaerofilne: Rastu uz nisku koncentraciju kisika ($5\text{--}6\,\%$).

    • Obligatni anaerobi: Kisik ih ubija jer nemaju enzime za razgradnju toksičnih produkata kisika (npr. Bacteroides).

  • Rast: Odvija se binarnom fisijom. Prosječno generacijsko vrijeme je $20\,\text{min}$ (kod M. tuberculosis je $24\,\text{h}$).

  • Uvjeti rasta: Mezofilne bakterije ($25\text{--}44\,^{\circ}\text{C}$), neutrofilne ($ ext{pH } 6\text{--}8$).

• Genetika bakterija

  • Kromosom: Dvolančana DNK u obliku zatvorene omče (haploidno stanje).

  • Plazmidi: Ekstrakromosomska kružna DNK; mogu biti transmisivni (geni za konjugaciju) ili netransmisivni.

  • Genetske promjene: Mutacija te izmjena materijala putem transformacije, transdukcije, konjugacije ili insercije transpozona.

• Bakterijski toksini

  • Egzotoksini:

    • Izlučuju ih i Gram-pozitivne i Gram-negativne stanice.

    • Polipeptidi su i djeluju udaljeno; visoko imunogenični.

    • Neurotoksini: C. tetani (risus sardonicus, spazam), C. botulinum (mlohava paraliza, smrtna doza iznosi samo $1\,\mu\text{g}$).

    • Enterotoksini: Uzrokuju proljev (Salmonella, V. cholerae) ili trovanje hranom (S. aureus).

  • Endotoksini:

    • Lipopolisaharid (Lipid A) u stijenci Gram-negativnih bakterija.

    • Otpuštaju se nakon raspada stanica. Uzrokuju pirogenost (vrućicu), vazodilataciju (šok), aktivaciju koagulacije (DIK) i komplementa.

• Patogenost i imunost

  • Patogenost: Sposobnost izazivanja bolesti. Virulencija je stupanj patogenosti.

  • Koraci infekcije: Adherencija $\rightarrow$ Infekcija (razmnožavanje) $\rightarrow$ Infektivna bolest.

  • Prirođena imunost: Mehaničke barijere, kemijske (suze, kiselina), mikrobiota, fagocitoza i citokini.

  • Stečena imunost: Humoralna (B-limfociti, protutijela) i stanična (T-limfociti, CD4+).

• Normalna mikrobiota čovjeka

  • Rezidentna: Stalno prisutna, brzo se obnavlja.

  • Tranzitorna: Prolazna, stečena iz okoline.

  • Lokacije:

    • Koža: S. epidermidis (KNS), S. aureus, Candida.

    • Gornji dišni put: S. pneumoniae, Haemophilus, viridans streptokoki.

    • Debelo crijevo: Najveća koncentracija ($10^{11}\text{--}10^{12}\,\text{CFU/g}$). Prevladavaju anaerobi (Bacteroides).

    • Urogenitalni sustav: Distalna uretra ima floru, mjehur i proksimalna uretra su normalno sterilni.

Kontrola bolničkih infekcija: HCAI i mjere izolacije

• Definicija HCAI (Infekcije povezane s bolničkom skrbi)

  • Infekcija se smatra bolničkom ako bolesnik pri prijemu nije bio u inkubaciji niti je imao simptome.

  • Vremenski okviri:

    • Više od $48\text{--}72\,\text{h}$ nakon prijema.

    • Unutar $10\,\text{dana}$ od otpusta.

    • Za kirurške rane: unutar $30\,\text{dana}$, odnosno unutar $1\, \text{godine}$ ako je implantiran strani materijal.

  • Incidencija: $5\text{--}10\,\%$ hospitaliziranih bolesnika.

• Povijesne crtice i organizacija

  • Ignaz Semmelweis ($1847.$): Uveo higijenu ruku i smanjio mortalitet rodilja s $20\text{--}25\,\%$ na minimalne razine.

  • Tim za kontrolu bolničkih infekcija: Sastoji se od liječnika za kontrolu BI, mikrobiologa i sestre za kontrolu BI (puno radno vrijeme).

• Higijena ruku i WHO standardi

  • Higijenska dezinfekcija: Redukcija prolazne flore.

  • Pranje ruku sapunom: Obavezno ako su ruke vidljivo prljave, nakon toaleta ili sumnje na spore Clostridioides difficile.

  • Utrljavanje alkohola: Najbrža i najučinkovitija metoda.

  • Pravilo 5 trenutaka: Prije dodira pacijenta, prije aseptičkih zahvata, nakon rizika od izlaganja izlučevinama, nakon dodira pacijenta i nakon dodira okoline pacijenta.

• Mjere izolacije prema putu prijenosa

  • Aerosolom: Čestice < 5\,\mu\text{m}. Potrebna jednokrevetna soba s negativnim tlakom. Primjeri: TBC, ospice, varicela.

  • Kapljično: Čestice brzo sedimentiraju. Maska se nosi u krugu od $"1\,\text{m}$. Primjeri: meningokok, influenca, H. influenzae.

  • Kontaktom: Izravno ili neizravno. Primjeri: multirezistentne bakterije (MRSA, ESBL), crijevni patogeni.

• Multirezistentni organizmi (MRO)

  • MRSA: Otporan na gotovo sve beta-laktame.

  • ESBL: Razara peniciline i cefalosporine; osjetljivi na karbapeneme.

  • KPE / Karbapenem-rezistentni: Razaraju gotovo sve dostupne beta-laktame.

  • VRE: Vankomicin-rezistentni enterokoki.

  • Procjena za $2050.$ godinu: $10\,\text{milijuna}$ smrti godišnje uzrokovanih rezistencijom; pad BDP-a za $1\text{--}4,5\,\%$.

• Dezinfekcija i sterilizacija

  • Čišćenje: Fizičko odstranjenje prljavštine; preduvjet za daljnje postupke.

  • Dezinfekcija: Uništava većinu MO na neživim predmetima (visoki stupanj ne uništava spore).

  • Sterilizacija: Potpuno uništavanje svih MO, uključujući spore.

  • Spauldingova kategorizacija ($1968.$):

    • Kritični predmeti: Kontakt s krvlju; obavezna sterilizacija.

    • Polukritični predmeti: Kontakt sa sluznicama; dezinfekcija visokog stupnja.

    • Nekritični predmeti: Kontakt s kožom; čišćenje.

  • Metode sterilizacije:

    • Suha toplina: $171\,^{\circ}\text{C} / 2\,\text{h}$.

    • Vlažna toplina (autoklav): $134\,^{\circ}\text{C} / 3\,\text{min}$ ili $121\,^{\circ}\text{C} / 15\,\text{min}$.

    • Plazma peroksid: $55\text{--}75\,\text{min}$ bez potrebe za odzračivanjem.

Infekcije mokraćnog sustava (IMS) i sepse

• Epidemiologija i obrana IMS

  • Najčešća bakterijska bolest. Čak $20\,\%$ žena doživi epizodu.

  • Obrambeni mehanizmi: Volumen urina, slobodan protok, kiselost urina ($ ext{pH}$), antibakterijski cink u prostati muškaraca.

  • Asimptomatska bakteriurija: Liječi se isključivo kod trudnica i prije uroloških zahvata.

• Laboratorijska dijagnostika i Kassov kriterij

  • Pravilno uzimanje: Srednji mlaz (nakon $4\,\text{h}$ nemokrenja). Čuvanje do $24\,\text{h}$ u hladnjaku.

  • Kassov kriterij za signifikantnu bakteriuriju:

    • $\ge 10^{5}\,\text{CFU/ml}$ ukazuje na IMS s vjerojatnošću od $95\,\%$.

    • < 10^{3}\,\text{CFU/ml} obično predstavlja kontaminaciju.

  • Sediment urina: Više od $10\,\text{leukocita/mm}^{3}$ znak je upale.

• Injekcije povezane s kateterom (CA-UTI)

  • Rizik raste svakim danom za $5\,\%$. Nakon $1\,\text{mjeseca}$ svi pacijenti imaju bakteriuriju.

  • Biofilm: Bakterije su do $1000\times$ otpornije unutar biofilma. Jedini lijek je uklanjanje katetera.

• Infekcije krvotoka (HK - Hemokulture)

  • Epidemiologija: $19\,\text{milijuna}$ oboljelih godišnje, $5\,\text{milijuna}$ smrtnih ishoda.

  • Klasifikacija bakterijemije:

    • Tranzitorna (obično nakon instrumentacije).

    • Intermitentna (česta kod nedreniranih apscesa).

    • Kontinuirana (endokarditis, kateter-sepsa).

  • Volumen krvi za HK:

    • Odrasli: $20\,\text{ml}$ po setu ($10\,\text{ml}$ po bočici; $1$ aerobna i $1$ anaerobna).

    • Dojenčad (< 1\,\text{kg}): $1\text{--}1,5\,\text{ml}$.

    • Vjerojatnost detekcije: $1\,\text{set} \approx 80\,\%$, $2\,\text{seta} \approx 90\text{--}95\,\%$, $3\,\text{seta} \approx 99\,\%$.

  • Obrada: Inkubacija na $37\,^{\circ}\text{C}$ tijekom $5\text{--}7\,\text{dana}$. Pozitivna HK je kritični nalaz.

• Sepsa povezana s CVK (Središnji venski kateter)

  • Smrtnost bolesnika s CR-BSI je visoka; oko $14.000$ umrlih godišnje.

  • Dijagnostika vrha katetera: Semikvantitativna metoda (> $15\,\text{CFU}$) ili kvantitativna (> $10^{3}\,\text{CFU/ml}$).

  • Paralelne HK: Uzorak iz CVK mora biti pozitivan barem $2\,\text{h}$ prije periferne HK da bi se dokazala kateter-sepsa.

Bakteriološka obrada i laboratorijske vježbe

• Mikroskopiranje i kvaliteta sputuma

  • Kvalitetan iskašljaj: Nalaz više od $25\,\text{PMN}$ (leukocita) i manje od $10\,\text{epitelnih stanica}$ pri povećanju $10\times10$.

  • Preliminarni zaključak se postavlja na temelju Gram bojanja (npr. Gram-pozitivni diplokoki u likvoru sugeriraju pneumokokni meningitis).

• Identifikacija Gram-negativnih bakterija

  • Biokemijski niz obuhvaća testove na fermentaciju glukoze i laktoze, te testove na indol i citrat.

  • Laktoza-pozitivne: E. coli, Klebsiella.

  • Laktoza-negativne: Proteus, Salmonella, Shigella.

• Identifikacija Gram-pozitivnih bakterija

  • Hemoliza na krvnom agaru:

    • $\alpha$ (zelena zona – S. pneumoniae, viridans).

    • $\beta$ (prozirna zona – S. pyogenes).

    • $\gamma$ (nema promjene – enterokoki).

  • Test katalaze: Razlikuje stafilokoke ($+$, mjehurići kisika) od streptokoka ($-$).

  • Test koagulaze: Razlikuje S. aureus ($+$, ugrušak) od KNS bakterija ($-$).

• Antibiogram i EUCAST standardi

  • Standardna metoda: Disk-difuzija na Mueller-Hinton agaru. Inokulum se podešava na McFarland $0,5$.

  • Interpretacija S/I/R:

    • S: Osjetljiv uz standardne doze.

    • I: Osjetljiv uz povećano izlaganje (veće doze).

    • R: Rezistentan (terapijski neuspjeh).

  • Primjer parametara: Rezistencija na cefoksitin kod stafilokoka znači MRSA.

Laboratorijska dijagnostika virusnih bolesti

• Metode dijagnostike

  • Izravna: Detekcija genoma (PCR), antigena ili izolacija na stanicama.

  • Neizravna (serologija): Detekcija protutijela IgG/IgM.

• Parni serumi: Uzimaju se dva uzorka u razmaku od $2\text{--}3\,\text{tjedna}$. Četverostruki porast titra označava akutnu infekciju.

• POCT (Point-of-care testing): Jednostavni testovi uz bolesnika (npr. OraQuick za HIV, dobiva se rezultat za $20\text{--}40\,\text{min}$).

• Transportni medij za viruse: Sadrži proteine (albumin), pufer i antibiotike (sprječava rast popratnih bakterija).

Specifične infekcije organskih sustava

• Infekcije dišnog sustava

  • Pneumonija: Incidencija u HR je $1,1\text{--}1,4\,\%$. Najčešći uzročnik izvanbolničkih je S. pneumoniae.

  • BAL (Bronhoalveolarna lavaža): Kvantitativni kriterij je $10^{4}\,\text{CFU/ml}$.

• Infekcije središnjeg živčanog sustava

  • Bakterijski meningitis: Karakteriziran niskom glukozom ($\le 40\,\text{mg/dL}$), visokim proteinima i velikim brojem leukocita ($1000\text{--}5000/\text{mm}^{3}$) s prevagom PMN-a ($\ge 80\,\%$).

• Infekcije probavnog sustava

  • Clostridioides difficile: Glavni rizik je uporaba antibiotika širokog spektra (klindamicin, cefalosporini). Dijagnosticira se dokazom toksina u stolici. Dezinfekcija okoline zahtijeva hipoklorit jer alkohol ne ubija spore.

Antibiotici i cjepiva

• Mehanizmi antibiotika:

  • Sinteza stijenke: Beta-laktami, vankomicin.

  • Sinteza proteina: Makrolidi, aminoglikozidi, tetraciklini.

  • Sinteza nukleinskih kiselina: Kinoloni.

• Rezistencija: Bakterije proizvode enzime poput beta-laktamaza (ESBL, karbapenemaze) ili mijenjaju ciljna mjesta ($PBP2a$ kod MRSA).

• Imunizacija:

  • Aktivna: Unos antigena (cjepiva). Postiže se dugotrajna memorija.

  • Pasivna: Unos gotovih protutijela (antitoksini za tetanus, botulizam). Štiti odmah, ali kratko.

Virusni hepatitisi, HIV i parazitologija

• Hepatitisi:

  • A i E: Prijenos feko-oralno (infektivni).

  • B, C i D: Parenteralni prijenos (serumski).

  • Hepatitis B: Marker replikacije je HBeAg. Rizik od uboda na iglu je čak $30\,\%$ ako je izvor HBeAg pozitivan.

  • Hepatitis C: Ne postoje protektivna protutijela; dijagnoza se potvrđuje s HCV-RNK.

• HIV (Virus humane imunodeficijencije):

  • Ciljne stanice su CD4+ T-limfociti. Kad broj padne ispod $200/\mu\text{L}$, razvija se AIDS.

  • U=U (Undetectable = Untransmittable): Osobe s nedetektabilnom viremijom (< 50\,\text{kopija/ml}) ne mogu spolno prenijeti virus.

• Parazitologija:

  • Toxoplasma gondii: Čovjek se zarazi mačjim oocistama ili tkivnim cistama iz mesa. Opasan je konatalni prijenos.

  • Enterobius vermicularis: Dijagnoza se postavlja perianalnim otiskom prozirnom trakom ujutro.

  • Scabies (šuga): Liječi se $25\,\%$ losionom benzilbenzoata kroz $5\,\text{dana}$. Sve kontakte treba liječiti istovremeno.