Enzymy - Wykład V

Ogólne właściwości

• Enzymy są biokatalizatorami, głównie białkami, ale także RNA (rybozymy) i DNA (DNA-zymy).

• Są wytwarzane tylko przez żywe komórki, ale mogą działać pozakomórkowo.

• Przyspieszają reakcje biochemiczne, zwiększając ich wydajność $10^6$ - $10^{11}$ razy.

• Charakteryzują się wysoką efektywnością.

• Nie zużywają się i nie zmieniają trwale podczas reakcji.

• Działają selektywnie, regulując procesy metaboliczne i wspomagając utrzymanie homeostazy.

• Nie zmieniają końcowego składu mieszaniny ani stałej równowagi reakcji odwracalnej.

• Przyspieszają osiągnięcie równowagi w reakcjach termodynamicznie możliwych.

• Zmieniają mechanizm reakcji, tworząc związki przejściowe.

• Szybkość reakcji enzymatycznej zależy od:

  • Lokalnego zwiększania stężenia substratu.

  • Utrzymania substratów w konformacji sprzyjającej reakcjom.

  • Dostarczenia reszt aminokwasowych z grupami funkcyjnymi katalizującymi reakcje.

  • Obniżenia energii aktywacji.

Nazewnictwo enzymów

• Nazwy powszechnie używane oparte są na:

  • Substracie (np. oksydaza ksantynowa).

  • Źródle (np. rybonukleaza trzustkowa).

  • Regulacji (np. lipaza wrażliwa na hormon).

  • Mechanizmie działania (np. proteaza cysteinowa).

  • Funkcji w organizmie (np. pepsyna).

  • Właściwościach (np. lizozym).

• Schemat nazewnictwa: substrat + przyrostek -aza (np. hydrolaza acetylocholiny)

• Inne przykłady: oksydoreduktaza alkohol:NAD+

• Numer EC (Enzyme Commission):

  • Przypisany każdemu enzymowi wg klasyfikacji IUBMB.

  • Składa się z czterech cyfr: klasa.podklasa.podpodklasa.nr w podpodklasie (np. 2.6.1.1 - transaminaza asparaginianowa).

• Klasy enzymów:

  • EC 1: Oksydoreduktazy – przenoszą elektrony i protony (dehydrogenazy, oksydazy).

  • EC 2: Transferazy – przenoszą grupy funkcyjne (transaminazy, kinazy).

  • EC 3: Hydrolazy – rozpad substratu pod wpływem wody, hydroliza (rozczepienie wiązań C-C, C-O, C-N).

  • EC 4: Liazy – rozpad substratu bez hydrolizy (rozszczepienie wiązań C-C, C-O, C-N, wytworzenie wiązania podwójnego).

  • EC 5: Izomerazy – zmieniają położenie grup chemicznych (geometryczne zmiany).

  • EC 6: Ligazy (syntetazy) – synteza (połączenie) cząsteczek z udziałem energii z ATP.

Klasyfikacja enzymów ze względu na budowę chemiczną

• Enzymy proste:

  • Zbudowane tylko z aminokwasów.

  • Grupa czynna to specyficzne zespoły aminokwasów.

  • Przykłady: proteazy, amylaza, RNaza.

• Enzymy złożone:

  • Składają się z części białkowej (apoenzym) i niebiałkowej (kofaktor).

  • Część niebiałkowa trwale związana to grupa prostetyczna (katalaza, peroksydaza, oksydaza cytochromowa).

  • Część niebiałkowa luźno związana to koenzym (obie części łatwo się oddzielają, żadna nie jest aktywna katalitycznie, ponowne połączenie przywraca aktywność, np. dehydrogenazy).

Budowa enzymu

• Centrum aktywne to zgrupowanie reszt aminokwasowych o odpowiednim ułożeniu przestrzennym.

• Decyduje o właściwościach katalitycznych enzymu.

• Determinuje wysoką sprawność katalityczną i odpowiada za specyficzność reakcji.

• Miejsce wiązania + miejsce katalityczne (grupa czynna).

Specyficzność enzymów

• Specyficzność substratowa:

  • Określa, jaki rodzaj substratu ulega przemianie.

  • Zależy od budowy miejsca wiązania.

• Specyficzność działania:

  • Katalizowanie reakcji tylko jednego typu.

  • Katalizowanie tylko jednego z wielu możliwych przekształceń danej substancji.

  • Zależna od budowy centrum katalitycznego.

Modele specyficzności enzymów

• Model "klucza i zamka" (Emil Fisher, 1894):

  • Enzym i substrat są geometrycznie dopasowane.

  • Wyjaśnia specyficzność, ale nie wyjaśnia stabilizacji stanu przejściowego.

• Model indukowanego dopasowania (Daniel Koshland, 1958):

  • Enzym zmienia konformację pod wpływem substratu, aby umożliwić katalizę.

  • Powoduje zbliżenie i ustawienie substratu oraz grup czynnych enzymu, a także wzrost naprężeń w substracie (kataliza przez odkształcanie substratu).

• Model "trzypunktowego dołączenia" (Alexander G. Ogston, 1948):

  • Enzymy reagują tylko z jedną odmianą stereoizomeryczną substratu.

  • Połączenie enzymu z substratem musi zachodzić co najmniej w 3 miejscach.

  • Nawet symetryczna cząsteczka staje się „asymetryczną” dla centrum aktywnego.

Teoria kinetyczna – teoria zderzeń

1. Reakcja zachodzi, gdy reagujące cząsteczki się zderzają.

2. Istnieje bariera energetyczna, która musi być przekroczona.

3. Cząsteczki muszą mieć wystarczającą ilość energii, aby przekroczyć tę barierę.

   • Zwiększenie energii lub częstości zderzeń substratów zwiększa szybkość reakcji.

• Enzymy zmieniają szybkość reakcji poprzez:

  • Lokalne zwiększanie stężenia substratu.

  • Utrzymanie substratów w konformacji sprzyjającej reakcjom.

  • Dostarczenie reszt aminokwasowych z grupami funkcyjnymi katalizującymi reakcje.

  • Obniżenie energii aktywacji dla tworzenia stanów przejściowych.

• Enzymy ustawiają substrat w przestrzeni w sposób najbardziej sprzyjający reakcji, zapewniając ścisłą orientację przestrzenną reagujących cząsteczek i zwiększając bliskość substratów.

• Enzymy obniżają energię aktywacji i ułatwiają zajście reakcji.

Kinetyka reakcji enzymatycznej

• Opisuje mechanizmy wiązania substratów przez enzymy i ich przekształcania w produkty.

• Kinetyka Michaelisa-Menten: dwuetapowy przebieg reakcji katalizowanej przez enzymy.

• Substraty wiążą się odwracalnie z enzymem, tworząc kompleks enzym-substrat (ES) ze stałą szybkości $k_1$.

• Kompleks ES może się rozpaść na dwa sposoby:

  • Dysocjować do E i S ze stałą szybkości $k_{-1}$.

  • Uwolnić produkty ze stałą szybkości $k_2$, przy czym zakłada się, że produkt nie może ulec powrotnemu przekształceniu w substrat.

${v = \frac{V<em>{max}*[S]}{K</em>m + [S]}}$

Czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznych

• Zwiększają energię kinetyczną reagujących cząsteczek.

• Obniżają barierę energetyczną.

• Zwiększają częstość zderzeń.

  • Stężenie substratu.

  • Stężenie produktu.

  • Stężenie enzymu.

  • Temperatura.

  • pH.

  • Obecność inhibitorów i aktywatorów.

Wpływ stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej

• Zwiększenie liczby cząstek mających dostateczną energię.

• Zwiększenie prawdopodobieństwa zderzeń ogółem, a przez to zderzeń efektywnych.

• Wzrost prędkości reakcji ma miejsce do momentu wysycenia wszystkich cząsteczek enzymu.

Wpływ temperatury na szybkość reakcji enzymatycznej

• Zwiększenie energii kinetycznej reagujących cząsteczek.

• Zwiększenie ilości cząsteczek o energii wyższej niż bariera energetyczna.

• Zwiększenie częstości zderzeń.

• Wzrost możliwości wytwarzania połączeń, które są mało prawdopodobne w normalnych warunkach.

• Zbyt wysoka temperatura – denaturacja białka enzymatycznego.

• Gorączka, hipotermia – zmiana aktywności enzymów organizmu.

Wpływ pH na szybkość reakcji enzymatycznej

• Optymalne wartości zwykle w przedziale 5,0 – 9,0.

• Zmiana ładunków elektrycznych grup dysocjujących lub zwiększenie/zmniejszenie liczby wiązań jonowych wewnąrz- i międzyłańcuchowych → zmiana układ łańcucha.

• Zmiana ładunków elektrycznych w cząsteczkach substratów.

• Denaturacja białka enzymatycznego przy dużych i małych wartościach pH.

• Kwasica, zasadowica – zmiana aktywności enzymów organizmu.

Inhibicja

• Zjawisko hamowania aktywności enzymów przez inhibitory.

• Mechanizm kontrolny dla procesów fizjologicznych.

  • Inhibicja odwracalna:

    • Kompetycyjna.

    • Niekompetycyjna.

    • Akompetycyjna.

  • Inhibicja nieodwracalna: inhibitor wiąże się trwale z enzymem, blokując jego aktywność.

Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca)

• Inhibitor i substrat współzawodniczą o miejsce aktywne enzymu.

• Związanie przez enzym inhibitora uniemożliwia związanie substratów (i vice versa).

• Maksymalna szybkość reakcji, $V_{max}$, nie zmienia się.

• $V_{max}$ może być osiągnięta poprzez zwiększenie stężenia substratów, które przezwycięży inhibicję.

• Wraz ze wzrostem stężenia inhibitora rośnie wartość $K_m$.

• Inhibitor jest strukturalnie podobny do substratu.

• Przykłady:

  • Metotreksat (inhibitor reduktazy dihydrofolianu).

  • Etanol (inhibitor kompetycyjny dla dehydrogenazy alkoholowej w zatruciach glikolem etylenowym).

Inhibicja niekompetycyjna

• Inhibitor wiąże się do wolnego enzymu, ale nie do jego miejsca aktywnego.

• Kompleksy enzym-inhibitor (EI) i enzym-inhibitor-substrat (EIS) są nieaktywne.

• Wiązanie inhibitora jest niezależne od substratu → wartość $K<em>m$ pozostaje stała, wartość $V</em>{max}$ maleje.

Inhibitory nieodwracalne

• "Trucizny" enzymów.

• Inhibitor wiąże się kowalencyjnie (nieodwracalnie) do łańcuchów białkowych enzymu lub bardzo silnie.

• Chemiczna modyfikacja aminokwasów w enzymie jest nieodwracalna.

• Przykłady:

  • Penicylina (inhibitor enzymów zawierających serynę).

  • Aspiryna (inhibitor cyklooksygenazy).

  • Związki fosforoorganiczne (insektycydy) – inhibitory acetylocholinoesterazy.

Kontrola (regulacja) aktywności enzymatycznej

• Wpływ na ilość: regulacja syntezy (indukcja/represja) i degradacji enzymów (półokres rozpadu białka $t_{1/2}$).

• Wpływ na rozmieszczenie przestrzenne: kompartmentacja.

• Wpływ na aktywność katalityczną:

  • Sprzężenie zwrotne (hamowanie).

  • Efektory allosteryczne (enzymy allosteryczne).

  • Zmiana struktury enzymu (modyfikacje kowalencyjne, aktywacja proteolityczna).

  • Kompleksy (układy) wieloenzymowe.

Kompartmentacja

• Fizyczne rozdzielenie przeciwstawnych szlaków metabolicznych.

  • W komórce: biosynteza kwasów tłuszczowych (cytozol), utlenianie kwasów tłuszczowych (mitochondrium).

  • W organizmie: niektóre szlaki tylko w wyspecjalizowanych komórkach.

• Kompartmentacja chemiczna: przeciwstawne szlaki biegną poprzez inne metabolity pośrednie.

Regulacja przez sprzężenie zwrotne

• Produkt hamuje proces enzymatyczny, w którym powstał (zwykle dotyczy szlaków syntezy).

• Hamowany jest początkowy etap syntezy.

• Inhibitor: ostatnia mała cząsteczka przed utworzeniem związku wielkocząsteczkowego.

• Produkt powoduje represję genu kodującego enzym (nie wpływa na aktywność katalityczną, ale na ilość).

• Przykład: cholesterol i reduktaza HMG-CoA.

Efektory allosteryczne

• Nie są podobne do substratów ani koenzymów danego enzymu.

• Łączą się z miejscem allosterycznym („inna przestrzeń”).

• Powodują zmiany konformacyjne w białku enzymatycznym (zmiana powinowactwa do substratu).

• Enzymy allosteryczne nie dają się opisać kinetyką M-M → krzywa sigmoidalna.

• Przykład: Karbamoilotransferaza asparaginianowa (ATCaza).

Modyfikacje kowalencyjne

• Odwracalne zmiany struktury cząsteczki enzymu.

• Przebiegają po zakończeniu translacji.

• Dodawanie grup funkcyjnych (fosforylacja, glikozylacja, ADP-rybozylacja, metylacja).

• Zmiana właściwości funkcjonalnych białek (konformacja, ładunek).

• Zmiana sprawności katalitycznej, powinowactwa do substratu, wewnątrzkomórkowej lokalizacji, regulacji przez ligandy allosteryczne.

• Zachodzą w momencie fizjologicznego zapotrzebowania.

Ograniczona proteoliza - proenzymy

• Proenzym (zymogen): nieaktywny prekursor enzymu.

• Do uaktywnienia wymaga jedno- lub kilkustopniowej proteolizy.

• Powstanie centrum katalitycznego (odcięcie fragmentu, przecięcie łańcucha polipeptydowego → zmiana konformacji).

• Przykłady:

  • Pepsynogen (→ pepsyna).

  • Trypsynogen (→ trypsyna).

  • Proinsulina (→ insulina).

  • Prokolagen (→ kolagen).

  • Czynniki krzepnięcia i fibrynolizy.

• Umożliwia szybką aktywację w momencie zapotrzebowania.

• Chroni tkanki produkujące proenzymy przed samostrawieniem.

Enzymy wielofunkcyjne i kompleksy wieloenzymowe

• Enzym wielofunkcyjny: jeden łańcuch polipeptydowy z co najmniej dwiema różnymi aktywnościami katalitycznymi i dwoma miejscami aktywnymi.

  • Przykład: syntaza kwasów tłuszczowych.

• Kompleks wieloenzymowy: układ kilku białek enzymatycznych o różnych aktywnościach katalitycznych połączone niekowalencyjnie.

  • Przykład: syntaza kwasów tłuszczowych u E.coli.

• Intermediaty przenoszone bezpośrednio z jednego miejsca aktywnego na drugie bez rozpraszania składników reakcji.

• Oddzielenie intermediatów od innych substancji – ochrona przed reakcjami współzaodniczącymi.