Comprehensive Notes on Electrophoresis

Eletroforese

Princípios da Eletroforese

A eletroforese é um método de separação que explora o movimento de moléculas carregadas em um campo elétrico. A velocidade de migração depende de vários fatores, incluindo a força do campo elétrico, a carga da molécula, seu tamanho e forma, bem como as propriedades do meio (força iônica, viscosidade e temperatura).

Técnicas Eletroforéticas:

• Eletroforese de zona (suporte sólido): A técnica mais comum.

• Focagem isoelétrica

• Eletroforese bidimensional

• Métodos de “Blotting”

• Eletroforese Capilar

Suportes Sólidos na Eletroforese

A maioria dos suportes são matrizes gelatinosas:

• Géis de acetato de celulose: Usados para analisar proteínas séricas (albumina, alfa-glicoproteínas, beta-glicoproteínas e gama-glicoproteína).

• Géis de agarose: Utilizados para a separação de ácidos nucleicos.

• Géis de poliacrilamida: Usados em eletroforeses de proteínas que requerem alta resolução e reprodutibilidade.

Eletroforese em Gel de Agarose

A agarose é um polissacárido extraído de algas marinhas, composto por unidades repetidas de galactose e desidro-galactose. A gelificação ocorre através do estabelecimento de ligações de hidrogênio entre as cadeias de agarose, formando uma estrutura porosa.

Fatores que afetam o tamanho dos poros:

• A concentração de agarose é inversamente proporcional ao tamanho dos poros. Maiores concentrações resultam em poros menores, e vice-versa.

Vantagens da Agarose:

• Não é tóxica.

Eletroforese de DNA

Os ácidos nucleicos possuem carga negativa devido aos grupos fosfato em sua estrutura. Em eletroforeses de DNA, essa carga intrínseca permite a migração em direção ao polo positivo sem a necessidade de aditivos.

Fatores que afetam a migração:

• Tamanho: Moléculas menores migram mais rapidamente.

• Forma: Moléculas circulares (plasmídeos) podem apresentar migração atípica, necessitando de enzimas de restrição para linearização.

• Concentração de Agarose: A concentração influencia a dureza do gel.

• Fragmentos de DNA entre 200 e 50.000 pares de bases podem ser separados.

A mobilidade dos fragmentos de DNA linear é inversamente proporcional ao $log_{10}$ da sua massa molecular.

Formas de DNA plasmídeo:

• Relaxadas (nicked circles): Migram mais lentamente.

• Super-enroladas (supercoiled): Migram mais rapidamente.

Concentração de Agarose e Separação de Fragmentos de DNA

• Maiores concentrações de agarose facilitam a separação de fragmentos menores de DNA.

• Menores concentrações de agarose permitem maior resolução de fragmentos maiores.

Relação entre concentração de agarose e gama de separação de DNA:

Métodos de Revelação/Detecção de DNA

Corantes intercalantes fluorescentes são comumente utilizados para visualização do DNA.

Exemplos de Corantes:

• Brometo de etídio

• Sybr Safe

• GelRed

• GelGreen

Brometo de Etídio

O brometo de etídio é um corante vermelho que aumenta sua fluorescência em cerca de 20 vezes quando ligado ao DNA. A fluorescência é excitada no UV próximo (320 nm) e emitida na região vermelho-laranja (510 nm).

Segurança:

• O brometo de etídio é um agente mutagênico e possivelmente carcinogênico, requerendo extremo cuidado no manuseio.

• Utilizar hotte e luvas de borracha de nitrile na manipulação.

GelRed™ e GelGreen®

GelRed e GelGreen são alternativas mais seguras ao brometo de etídio, sendo menos tóxicos e ambientalmente amigáveis. São utilizados para coloração de DNA e RNA em géis de agarose ou poliacrilamida.

Coloração Pré-Eletroforese com GelRed:

1. Preparar o gel de agarose.

2. Diluir o GelRed 10.000x diretamente na solução de agarose (1:10.000).

3. Homogeneizar completamente a solução.

4. Permitir a solidificação e visualizar em transiluminador (302-312 nm) após a eletroforese.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)

A poliacrilamida é um polímero de cadeias de acrilamida ligadas por metileno bis acrilamida. A polimerização é iniciada pelo persulfato de amônia e catalisada por TEMED (N, N, N', N'-tetrametilenodiamina).

Segurança:

• A acrilamida é extremamente tóxica (cancerígena e neurotóxica), exigindo o uso de luvas e máscara.

• O gel polimerizado é menos tóxico, mas o uso de luvas é recomendado devido a possíveis resíduos de acrilamida.

Fatores que afetam as propriedades do gel:

• Concentração de acrilamida: Determina o comprimento das cadeias do polímero.

• Concentração de bis acrilamida: Determina o grau de “cross-linking”.

• A concentração de acrilamida pode variar entre 3.5% (géis frágeis) e 20% (géis duros).

Concentração de Acrilamida e Gama de Separação

Em géis de agarose, fragmentos de DNA entre 200 e 50.000 pares de bases podem ser separados.

Condições da Eletroforese de Proteínas

A eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida pode ser realizada em:

• Condições nativas: A separação depende do tamanho, forma e carga da proteína.

• Condições desnaturantes: Utilizam detergentes (SDS, CTAB) para desnaturar as proteínas e agentes redutores (β-mercaptoetanol ou DTT) para romper ligações dissulfeto.

Detergentes:

• Aniônicos: SDS (sulfato dodecil de sódio), CTAB (brometo de cetiltrimetil amônia)

• Não iônicos: Triton X-100

Agentes redutores:

• β-mercaptoetanol ou DTT (ditiotreitol)

Eletroforese em Condições Nativas

Sob condições nativas, a separação das proteínas depende de vários fatores, incluindo tamanho, forma e carga.

Aplicações:

• Detecção de variações na carga da proteína (devido a degradação química).

• Análise de variações na conformação e agregação (estudos de interação proteína-proteína, proteína-ligando).

• Análise da estabilidade das amostras.

Vantagens:

• Possibilidade de recuperação das amostras após a corrida da eletroforese.

Eletroforese em Condições Desnaturantes (SDS-PAGE)

O SDS é um detergente aniônico que dissolve moléculas hidrofóbicas e causa a desnaturação das proteínas, quebrando interações não covalentes. Ele se liga às cadeias polipeptídicas em uma proporção de cerca de um ânion SDS por cada 2 resíduos de aminoácido, conferindo carga negativa uniforme.

• A separação é feita exclusivamente em função da massa molecular.

Agentes Redutores: β-Mercaptoetanol (ou Ditiotreitol – DTT)

O β-mercaptoetanol e o DTT são agentes redutores que quebram (por redução) as ligações dissulfeto. Muitas proteínas contêm ligações dissulfeto, formadas pelas cadeias laterais das cisteínas, adicionando grande estabilidade às proteínas. Estas ligações podem ser intra ou intercadeias polipeptídicas.

Analisar a massa molecular na presença e ausência de agente redutor permite quantificar o número e o tipo de ligações dissulfeto.

Preparação da Amostra para SDS-PAGE

As amostras de proteínas são preparadas em um tampão de amostra contendo:

• 2% SDS (desnaturação)

• 20% glicerol (aumenta a densidade da amostra)

• 20 mM Tris-HCl pH=8.0

• 2 mM EDTA (quelante, reduz a atividade de enzimas proteolíticas)

• Agente redutor (β-mercaptoetanol ou DTT)

• Azul de bromofenol (indicador da frente de migração)

Para completar a desnaturação, as amostras são aquecidas a 100°C durante 2 minutos.

Quantidade de Amostra

A quantidade de amostra é crucial:

• Excesso: Pode causar precipitação e agregação de proteínas, resultando em manchas sem resolução.

• Insuficiente: Apenas as proteínas mais abundantes são detectadas.

Sistemas de Gel: Contínuo vs. Descontínuo

Sistema Contínuo:

• O gel possui uma concentração constante de acrilamida.

Sistema Descontínuo:

• Utiliza dois géis com diferentes concentrações de acrilamida: gel de empacotamento e gel de resolução.

• Gel de empacotamento (stacking gel): Baixa concentração de acrilamida (poros grandes), concentra a amostra.

• Gel de resolução (separating gel): Maior concentração de acrilamida, separa as proteínas de acordo com a massa molecular.

Gel de Empacotamento vs. Gel de Resolução

• Gel de empacotamento: Concentra a amostra para formar bandas finas antes de entrar no gel de resolução (pH=6.8, tampão Tris-HCl).

• Gel de resolução: Separa as proteínas de acordo com a massa molecular (pH=8.8, tampão Tris-HCl).

O tampão de corrida é um tampão de Tris-glicina a pH=8.3. A glicina apresenta-se com carga negativa neste pH, mas no gel de empacotamento fica essencialmente na forma zwiterónica (quase não se move no gel). No gel de empacotamento os iões $Cl^-$ andam rapidamente. O “complexo” proteína-SDS fica “entre” $Cl^-$ e glicina numa estreita zona. Ao chegar ao gel de resolução (pH= 8.8) a glicina fica negativa, migrando mais rapidamente, deixando o “complexo” proteína-SDS migrar em função do tamanho.

Revelação/Detecção das Manchas no Gel

A detecção pode ser feita com soluções corantes ou explorando propriedades específicas dos componentes das manchas (ex: radioatividade, luminescência).

Corantes Utilizados:

• Azul de Coomassie (proteínas; limite de deteção: 0.1–0.5 mg)

• Nitrato de prata (proteínas; limite de deteção: 0.2 – 0.6 ng)

Azul de Coomassie

O Azul de Coomassie é um dos corantes mais utilizados na detecção de proteínas em géis de poliacrilamida. A deteção é feita com o corante a 0.1% numa solução a 50% de metanol e 10% ácido acético. O metanol acidificado precipita as proteínas, e o corante liga-se permanentemente às proteínas. O excesso de corante é removido com uma solução de descorante (metanol/ácido acético).

Problemas Comuns em Géis:

• Grandes manchas: Amostras de proteínas demasiado concentradas.

• Bandas “às riscas”: Precipitação da proteína.

• Bandas demasiado claras: Quantidade de proteína insuficiente.

• Problema de coloração: Corante contaminado com SDS.

Problemas Comuns e Soluções

• A frente do solvente com o azul de Coomassie não se observa: tempo de corrida demasiado longo.

• A corrida do gel foi parada antes de tempo: piorando a resolução do gel.

• Amostras postas nos poços sem iniciar logo a eletroforese: difusão das proteínas.

Problemas Comuns e Soluções (cont.)

• Gel retirado da tina antes do fim da corrida com o power ON.

• “Ondinhas”: Corrente aplicada demasiado alta, grande produção de calor.

Métodos de Coloração com Nitrato de Prata

Os métodos de coloração com nitrato de prata são cerca de 10–100 vezes mais sensíveis do que o azul de coomassie. Impregna-se o gel com uma solução de iões de prata e em seguida trata-se com formaldeído, reduzindo os iões de prata a prata metálica, formando-se um precipitado castanho. Esta redução é promovida pelas proteínas.

Coloração de Proteínas Hémicas

Devido à atividade peroxidase associada aos hemos, é possível visualizar num gel apenas as proteínas hémicas. A solução de TMBZ (3,3´,5,5´tetrametilbenzidina) é incolor. Na presença de $H<em>2O</em>2$ é oxidada originando um precipitado insolúvel de cor azul. A peroxidase catalisa esta reação.

• O tampão das amostras não deve conter nenhum agente redutor.

Aplicações da Eletroforese

Determinação da Massa Molecular:

As distâncias de migração de proteínas em SDS PAGE variam na razão inversa do logaritmo da sua massa molecular. Incluem-se proteínas de massas moleculares conhecidas para construir uma reta de calibração e determinar a massa molecular de uma proteína desconhecida.

• $distância \ de \ migração = f(log \ Massa \ Molecular)$

Focagem Isoelétrica (FI)

As moléculas migram sob ação de um campo elétrico num gel que contém um gradiente de pH. A migração das moléculas pára quando é atingido o respectivo ponto isoelétrico (pI).

• Técnica aplicada a moléculas anfotéricas (que podem ser positiva ou negativamente carregadas).

• Baseia-se nas diferenças dos pontos isoelétricos das proteínas.

A carga líquida de uma proteína é zero no seu ponto isoelétrico (pI). Uma proteína com muitos aminoácidos básicos (Arg, Lys e His) terá um pI básico e uma proteína com muitos resíduos ácidos (Glu e Asp) terá um pI ácido. O pI de uma proteína pode ser alterado por modificações químicas como fosforilações.

Para cada proteína existe um valor de pH para o qual a carga da mesma é zero (pI, ponto isoelétrico), que geralmente se situa entre 3 – 12.

A focalização isoelétrica é realizada em géis de poliacrilamida contendo um gradiente de pH que pode ser de dois tipos:

• Tampões anforéticos (free carrier ampholytes)

• Gradientes imobilizados de pH (Immobilines)

Preparação da Amostra para Focagem Isoelétrica

As proteínas devem estar completamente solubilizadas, desagregadas, desnaturadas e reduzidas, com todas as interações macromoleculares quebradas.

Rompimento das interações não covalentes:

• Agentes caotrópicos: mistura ureia-tioureia

• Detergentes: não iônicos ou zwitter-iônicos (Triton X-100)

Agente redutor:

• Ditiotreitol (DTT): forte agente redutor, limitado a pHs acima de 7.

• TBP (tributilfosfina): agente redutor mais potente, mas volátil e tóxico.

Remoção de sais:

A remoção de sais é extremamente importante na preparação das amostras, pois os sais interferem diretamente no processo eletroforético. Os sais migram através do gradiente de pH produzindo calor e acumulando-se nas duas extremidades. Isso causa alta condutividade, queda de voltagem e diminuição do campo elétrico. A remoção de sais pode ser feita por precipitação ou diálise.

2D PAGE

Ao combinar dois processos de separação distintos, a eletroforese de um gel bidimensional pode ser usado para separar mais de 1000 proteínas. A focagem isoelétrica ao ser combinada com SDS PAGE gera géis bidimensionais. Numa primeira etapa as proteínas são separadas em função da sua carga nativa, sendo separadas por um processo de focagem isoelétrica. Numa etapa posterior o gel de poliacrilamida com forma de cilindro que contém as proteínas separadas por focagem isoelétrica é sujeito, novamente, a eletroforese mas numa direção em ângulo reto àquela usada na primeira etapa.

Cada spot é uma proteína. O spot pode ser retirado do gel e identificado por sequenciação do N-terminal ou por espetrometria de massa. Mais de 2000 proteínas podem ser resolvidas e identificadas num único gel.

A eletroforese 2D permite separar as várias formas proteicas que tenham sofrido modificações pós-tradução. A separação destas formas é possível visto que essas modificações conferem propriedades diferentes à proteína, em particular, um diferente pI ou peso molecular.

Ciências Ómicas

Conjunto de tecnologias que medem algumas características de uma enorme família de moléculas celulares, tais como os genes, proteínas, ou pequenos metabolitos.

• Genomics – estudo dos genes e as funções

• Proteomics – estudo das proteínas

• Metabolomics – estudo das moléculas envolvidas no metabolismo celular

• Transcriptomics - estudo do mRNA

• Glycomics - estudo dos carbo-hidratos celulares

• Lipomics - estudo dos lípidos celulares

• Peptidomics - estudo dos peptídeos

• Metallomics – semelhante à proteómica e à metabolómica, mas com especial interesse nas metalo-proteínas e nas concentrações de metais na célula.

O proteoma é o conjunto de proteínas que pode ser encontrado numa célula específica quando esta está sujeita a um certo estímulo. Grosso modo, é o equivalente proteico ao genoma. O proteoma reflete o estado atual de funcionamento do sistema em condições fisiológicas específicas, ou seja, a expressão do genoma funcional. O proteoma da célula é bastante dinâmico dependendo do seu estado de desenvolvimento, da presença de ativadores ou inibidores e também das condições específicas do meio ambiente.

Análise Proteómica

A Análise proteómica consiste no estudo do proteoma utilizando técnicas de separação e identificação, tais como eletroforese bidimensional, cromatografia líquida multidimensional, espectrometria de massas e bioinformática

Abordagem experimental:

• Extração das proteínas – disrupção das células. A solução de solubilização deve conter agente desnaturante (ureia / tioureia), detergente não iónico ou zwitteriónico (CHAPS, Triton X-100, ASB-14) e agente redutor (DTT).

• Remoção de interferentes: Remoção de sais, metabolitos, lípidos detergnetes incompatíveis com a eletroforese 2D.

• Quantificação de proteínas

A força iónica da amostra deve o mais baixo possível.

Focagem isoelétrica (1.ª dimensão)

As proteínas são separadas em função do seu pI num gel de poliacrilamida que possui um gradiente de pH imobilizado – strip IPG (Imobilized pH Gradient).

SDS – PAGE (2.ª dimensão)

Após a focagem isoelétrica, as strips têm de ser preparadas para a 2.ª dimensão, sendo imersas numa solução de equilíbrio que contem:

• DTT – manter o estado reduzido e desnaturado das proteínas

• Iodoacetamida – alquilação nos resíduos de cisteína, impedindo a reoxidação durante a eletroforese

Em seguida as strips IPG são colocadas no topo do gel de poliacrilamida e segue-se a 2.ª dimensão, SDS-PAGE, na qual as proteínas são separadas de acordo com a massa molecular.

Visualização dos spots - coloração:

Após a segunda dimensão, é necessário visualizar as proteínas separadas no gel. Existem 3 tipos de coloração:

• Azul de Coomassie, Nitrato de Prata e Corantes fluorescentes - DiGE

DiGE – técnica de marcação e separação de proteínas que permite uma análise proteómica quantitativa de duas amostras, em simultâneo no mesmo gel, por deteção da fluorescência de proteínas marcadas com sondas diferenciadas.

Para a identificação das proteínas correspondentes aos spots bem separados por eletroforese 2D, recorre-se a técnicas analíticas que permitam a sua identificação. Atualmente, o maior destaque vai para a espetrometria de massa.

Limitações da abordagem 2D-PAGE

• Dificuldade de automação

• Incapaz de detetar, identificar e quantificar todas as proteínas de amostras complexas simultaneamente

• Dificuldade de resolver proteínas extremamente ácidas ou básicas, assim como as muito hidrofóbicas.

Outras Técnicas Eletroforéticas

• EMSA – Electrophoretic Mobility Shift Assay (Interação entre proteínas e ácidos nucleicos)

Métodos de Blotting

Muitas vezes é necessário extrair proteínas ou ácidos nucleicos das bandas de um gel de eletroforese para posterior caraterização. O termo “blotting” refere-se à transferência de amostras biológicas de um gel para uma membrana onde são fixadas por adsorção ou covalentemente e onde poderão ser analisadas.

Tipos de Blotting:

• Southern Blotting – usada para localizar e identificar genes em fragmentos de DNA.

• Northern Blotting – uma variação do Southern blotting, mas para localizar e identificar genes em fragmentos de RNA.

• Western Blotting – uma variação que envolve a deteção de proteínas. Esta técnica também pode ser designada por imunoblotting (devido à utilização de anticorpos na deteção específica de antigenes).

Southern Blotting:

Técnica capaz de detetar um único fragmento de restrição específico numa mistura complexa de fragmentos produzidos pela clivagem de DNA com uma enzima de restrição, mesmo no caso da clivagem de todo o genoma, inclusivé o humano.

Northern Blotting:

É um blotting dirigido para RNA: a amostra de RNA é desnaturada por forma a que estas moléculas se mantenham lineares. Os RNAs são separados por eletroforese e transferidos para um filtro de nitrocelulose. O filtro é então exposto a sondas marcadas radioativamente e complementares ao gene de interesse. Finalmente, o filtro é sujeito a auto-radiografia. Esta técnica pode ser utilizada para conhecer os níveis de transcrição a ocorrer numa determinada célula.

Western Blotting:

Inicialmente as proteínas são separadas por SDS - PAGE e, posteriormente, são transferidas para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF), do mesmo modo que foram separadas no SDS-PAGE. A razão para a transferência das bandas de proteínas para uma membrana de nitrocelulose é permitir a chegada dos anticorpos às bandas com maior facilidade e eficácia, já que o gel de poliacrilamida não permite a difusão de grandes moléculas.

Aplicações no Diagnóstico

Existem pessoas que têm dificuldade em eliminar certas drogas do seu organismo. Esta deficiência está ligada ao gene X que codifica a proteína Y.

• Southern Blotting – digestão do DNA com uma enzima de restrição HIndIII.

• Northern Blotting – análise do mRNA.

• Western Blotting – anticorpo específico para a proteína Y.