Rangkuman Modul Praktikum Mikrobiologi Lingkungan

PRAKTIKUM 1. BEKERJA DI RUANG PRAKTIK MIKROBIOLOGI

Tujuan

Memperkenalkan prinsip-prinsip berpraktikum, alat/bahan, cara penggunaan, dan pemeliharaan.

Landasan Teori

Mengenal alat-alat laboratorium mikrobiologi dan fungsinya.

Alat-alat Laboratorium Mikrobiologi

a. Mikroskop

  • Alat untuk memberikan bayangan yang diperbesar dari benda-benda kecil.

  • Terdiri dari kombinasi alat optik.

  • Bagian-bagian mikroskop harus bersih.

  • Macam-macam mikroskop:

    1. Mikroskop Cahaya

      • Menggunakan alat-alat optik untuk mengamati preparat transparan.

      • Mikroskop ultraviolet: menggunakan cahaya ultraviolet, bayangan direkam pada piringan peka cahaya, menggunakan lensa kuarsa.

    2. Mikroskop Pendar

      • Untuk mendeteksi benda asing atau antigen dalam jaringan.

    3. Mikroskop Medan Gelap

      • Untuk mengamati bakteri hidup, terutama yang sangat tipis.

    4. Mikroskop Fasekontras

      • Untuk mengamati benda hidup dalam keadaan alaminya tanpa pewarnaan.

      • Menggunakan perlengkapan fase kontras di bawah meja objek dan pada lensa objektif.

    5. Mikroskop Elektron

      • Untuk melihat komponen sel yang sangat kecil seperti mitokondria, ribosom, dan retikulum endoplasma.

      • Menggunakan berkas elektron.

      • Daya pisah lebih besar dari 1 nm, perbesaran sampai sejuta kali diameter.

      • Asam fosfotungstat digunakan sebagai zat pewarna negatif.

    6. Mikroskop Elektron Pemayaran

      • Menggunakan berkas elektron yang difokuskan sebagai titik kecil dan digerakkan maju mundur pada spesimen.

b. Inkubator

  • Peralatan untuk inkubasi mikrobia pada suhu tertentu.

  • Shaker inkubator digunakan untuk media cair yang memerlukan kondisi homogen selama inkubasi.

c. Otoklaf

  • Peralatan sterilisasi dengan uap bertekanan tinggi.

  • Uap air bertekanan mencapai temperatur 121^\circ C pada tekanan 1-2 atmosfer.

  • Waktu sterilisasi: peralatan gelas dan air distilasi (20-30 menit), media (15 menit).

d. Laminar Flow

  • Lemari kaca untuk isolasi mikroba.

  • Dilengkapi blower, sinar UV (untuk sterilisasi), dan lampu penerangan.

  • Tidak cocok untuk isolasi mikroba skala besar.

e. Spectronic 20 D

  • Alat untuk menghitung populasi mikroba berdasarkan tingkat kekeruhan media cair yang bening.

  • Menghitung mikroba secara matematis dari tingkat kekeruhan.

  • Tidak menghitung jumlah mikroba sebenarnya.

f. Colony Counter

  • Ruang hitung untuk menghitung jumlah koloni, satuan (Cfu/ml).

g. Freezer

  • Peralatan seperti refrigerator dengan suhu mencapai titik beku air.

  • Untuk menyimpan biakan mikroba atau bahan yang memerlukan kondisi tersebut.

h. Jarum Ose

  • Jarum inokulasi, terbuat dari nikrom atau platina dengan gagang logam.

  • Mudah disterilkan dengan insinerasi pada nyala api.

  • Ujung kawat berbentuk lurus atau lingkaran.

i. Alkohol 70 %

  • Efektif untuk sterilisasi dan desinfeksi.

  • Mendenaturasi protein dengan dehidrasi dan melarutkan lemak.

  • Merusak membran sel dan menonaktifkan enzim.

j. Lampu Spiritus dan Pembakar Gas "Bunsen"

  • Untuk sterilisasi dengan insinerasi dan membuat kondisi steril.

  • Bunsen burner dilengkapi sumber bahan bakar gas dengan jaringan pipa, pia pencampur gas dan udara, serta lubang pengatur udara.

k. Cawan Petri

  • Wadah media untuk menanam mikroba.

  • Memudahkan perhitungan mikroba karena pembiakan dilakukan dalam skala kecil sehingga mudah diambil sampel dengan perbandingan tertentu.

  • Tidak cocok untuk pembiakan mikroba skala besar.

l. Tabung Reaksi

  • Alat gelas berbentuk silindris, fungsi sama seperti cawan petri.

  • Media dimiringkan (30-45°) atau diisi dengan media cair.

  • Tidak memberikan kemudahan dalam menghitung mikroba secara langsung atau pengamatan karakteristik mikroba.

Alat dan Bahan

Inkubator, freezer, sentrifuge, neraca analitik, otoklaf, waterbath, shaker, efendorf, tabung reaksi, erlenmeyer, gelas piala, pipet volumeter, spectronic 20 D, mikroskop, colony counter, jarum ose, vortex mixer, laminer flow, hot plate.

Cara Kerja

  1. Mengamati semua alat dan bahan yang ada di ruang mikrobiologi.

  2. Mencatat fungsi dari masing-masing alat dan bahan tersebut pada lembar pengamatan.

Daftar Pertanyaan

  1. Jelaskan perbedaan antara mikroskop fase kontras dan mikroskop medan terang?

  2. Berikan alasan mengapa peralatan di ruang mikrobiologi banyak yang terbuat dari gelas!

  3. Mengapa sterilisasi dengan cara Tyndalisasi harus dilakukan sampai tiga kali, jelaskan?

  4. Apa keuntungan dari penggunaan sterilisasi udara panas? Jelaskan!

  5. Apa keuntungan dari penggunaan sterilisasi menggunakan uap bertekanan? Jelaskan!

Daftar Pustaka

  • Balbach, M dan LC Blis. 1996. A Laboratory Manual for Botany. Sauders Colage Publishing, Ney York.

  • Kamajaya.1996. Sains Biologi. Ganeca Exact, Bandung.

  • Lim, D. 1998. Microbiology, 2 nd Edition. Mc Rrow Hill Book, New York.

  • Pramesti, HT. 2000. Mikroskop dan Sel FK. Unlam, Banjarbaru.

  • Purba, M. 1999. Kimia. Erlangga, Jakarta.

  • Winatasasmita, D. 1986. Fisiologi Hewan dan Tumbuhan. Universitas Indonesia, Jakarta.

PRAKTIKUM 2. STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA MIKROBIA

Tujuan

Mempelajari proses sterilisasi dan tahapan preparasi media tumbuh mikroba.

Landasan Teori

Sterilisasi adalah proses mematikan semua organisme pada atau di dalam suatu benda. Metode sterilisasi utama: penggunaan panas, bahan kimia, dan penyaringan (filtrasi). Sterilisasi panas dapat berupa panas lembab (dengan uap air) atau panas kering (tanpa kelembaban). Sterilisasi kimiawi menggunakan gas atau radiasi. Pemilihan metode disesuaikan dengan sifat bahan yang akan disterilkan. Metode sterilisasi umum di laboratorium mikrobiologi menggunakan panas dibahas lebih rinci.

Cara Sterilisasi

Bergantung pada bahan/alat yang akan disterilisasikan:

  1. Pemanasan: merusak atau membunuh mikrobia.

    • Pemanasan kering: membakar dan menggunakan uap panas.

    • Pemanasan basah: merebus dengan uap air panas, autoclave, dan pasteurisasi.

  2. Sterilisasi dengan filtrasi: untuk media yang tidak tahan panas (vaksin, serum, enzim, vitamin).

  3. Cara kimia: menggunakan bahan kimia berupa desinfektan dan antiseptik.

  4. Sterilisasi dengan penyinaran (radiasi): digunakan bila cara sterilisasi panas atau dingin tidak dapat dilakukan.

Media Pertumbuhan

Media adalah bahan yang terdiri dari campuran zat hara (nutrient) untuk membiakkan mikroba. Media digunakan untuk isolasi, perbanyakan, pengujian sifat fisiologis, dan perhitungan jumlah mikroba. Syarat media:

  • Mengandung semua zat hara yang mudah digunakan mikroba.

  • Tekanan osmosis, tegangan permukaan, dan pH sesuai kebutuhan mikroba.

  • Tidak mengandung zat penghambat pertumbuhan mikroba.

  • Steril sebelum digunakan.

Media selektif mengandung zat kimia yang menghambat pertumbuhan organisme yang tidak diinginkan. Bahan yang paling umum untuk media padat adalah agar. Media komersial tersedia dalam bentuk bubuk atau siap pakai. Kegunaan media di laboratorium:

  1. Untuk pembiakan bakteri.

  2. Untuk isolasi bakteri agar didapatkan biakan murni.

  3. Untuk menyimpan bakteri yang telah murni.

  4. Untuk mempelajari sifat-sifat pertumbuhannya (culture characteristic).

Jenis Media

  1. Media umum: untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan satu atau lebih kelompok mikroba secara umum.

  2. Media pengaya: memberikan kesempatan terhadap suatu jenis atau kelompok mikroba untuk tumbuh menjadi cepat.

  3. Media selektif: hanya dapat ditumbuhi oleh satu atau lebih jenis mikroba tertentu, menghambat atau mematikan jenis lainnya.

  4. Media diferensiasi: untuk pengujian senyawa atau benda tertentu dengan bantuan mikroba.

  5. Media penguji: untuk pengujian senyawa atau benda tertentu dengan bantuan mikroba.

  6. Media enumerasi: untuk menghitung jumlah mikroba pada suatu bahan.

Pemindahan biakan bakteri dengan kawat inokulasi diawali dengan ujung kawat yang dipijarkan, sisanya dilewatkan dengan api. Setelah dingin, ujung kawat disentuhkan ke koloni. Mulut tabung dipanasi setelah sumbatan diambil, lalu dipanasi lagi setelah pengambilan selesai dan disumbat seperti semula. Ujung kawat yang membawa biakan murni tersebut digoreskan pada media baru.

Alat dan Bahan

Labu ukur, erlenmeyer, hot plate, magnetic stir, neraca analitik, otoklaf, inkobator, nutrien agar, kentang, aquades.

Prosedur Kerja

Pembuatan Nutrien Agar

  1. Aquades dimasukkan ke dalam gelas ukur 500 ml.

  2. Dituangkan ke dalam erlenmeyer.

  3. Disiapkan 10 gram nutrien agar.

  4. Disiapkan hot plate.

  5. Erlenmeyer berisi aquades diletakkan di atas hot plate.

  6. Dimasukkan magnetik stir.

  7. Dimasukkan 10 gram NA.

  8. Suhu diatur bertahap. Jika mendidih atau berbuih, temperatur diturunkan dan media diangkat.

  9. Media dimasukkan ke otoklaf untuk sterilisasi.

  10. Media diinkubasi paling sedikit 2 x 24 jam.

Pembuatan Media Potato Dextrose Agar (PDA)

  1. Disediakan 19,5 gr PDA.

  2. Dilarutkan dengan akuades dan diaduk hingga 500 ml, dimasukkan ke dalam erlenmeyer, dan diletakkan di atas hot plate.

  3. Magnetik stiter dimasukkan dalam erlenmeyer, dipanaskan hingga sebelum mendidih. Magnetik stiter berputar menghomogenkan larutan.

  4. Media PDA diangkat.

  5. Media disterilkan menggunakan otoklaf pada temperatur 121^oC, tekanan 1-2 atm selama 15 menit.

  6. Media yang sudah steril dapat dibuat dalam berbagai bentuk.

Daftar Pertanyaan

  1. Bagaimana cara memeriksa media yang akan digunakan dalam keadaan steril?

  2. Mengapa sterilisasi perlu dilakukan terhadap media tumbuh sebelum dibuang?

  3. Jelaskan fungsi dari bahan beef ekstrak dan pepton bagi pertumbuhan bakteri?

  4. Untuk menyiapkan 1000 ml nutrient agar anda harus menimbang sebanyak 23 g media bahan. Bila anda hanya memerlukan 250 ml nutrient agar, maka anda perlu menimbang sebanyak?

Daftar Pustaka

  • Dwidjoseputro, D. 1998. Dasar-dasar Mikrobiologi. Penerbit Djambatan, Jakarta.

  • Hadioetomo, RS. 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. PT. Gramedia, Jakarta.

  • Sutedjo. 1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta, Jakarta.

PRAKTIKUM 3. ISOLASI DAN PEMURNIAN MIKROBA

Tujuan

Mempelajari teknik-teknik isolasi mikroba dan pemurniannya.

Landasan Teori

Isolasi bakteri adalah cara untuk memisahkan mikroba tertentu dari lingkungannya sehingga diperoleh kultur murni. Metode isolasi: metode gores, metode tuang, metode sebar, metode pengenceran, dan micromanipulator. Teknik cawan tuang dan cawan gores paling sering digunakan. Kedua metode ini mengencerkan organisme sedemikian rupa sehingga individu spesies dapat dipisahkan dari lainnya.

Alat dan Bahan

Tabung reaksi steril, cawan petri, vortex mixer, ependorf pipet, pipet volumentrik, lampu spiritus, ertas lebel, alkohol 70%, spiritus, alumunium foil, kapas, karet, media nutrient agar, akuades, sumber bakteri (air sumur, air kemasan, air ledeng, tanah kebun, dan tanah sampah).

Prosedur Kerja

Sampel Air (isolasi dan pemurnian bakteri)

  1. Diambil 1 ml sampel air ependorf.

  2. Diencerkan sampai 10^{-6} (sampel air kemasan diencerkan sampai 10^{-3}, mulut tabung reaksi dipanaskan dengan api bunsen).

  3. Tabung reaksi dimasukkan vortex mixer.

  4. Diambil sampel sebanyak 1 ml dari pengenceran 10^{-4}, dengan sistem doplo.

  5. Cawan petri dipanaskan sekelilingnya dengan api.

  6. Dimasukkan sampel dan ditambahkan media sampai memenuhi dasar cawan.

  7. Diputar cawan petri searah angka delapan.

  8. Direkatkan cawan petri dengan mengelilingkan plastik penutup pada sekeliling cawan.

  9. Dilakukan langkah 4 sampai seterusnya untuk pengenceran 10^{-5}, 10^{-6}.

  10. Cawan-cawan tersebut diinkubasi selama 1 x 24 jam.

  11. Dari koloni yang terpisah dimurnikan secara goresan. Selanjutnya dipindahkan ke media agar miring.

Sampel Tanah (isolasi dan pemurnian jamur)

  1. Dibuat media Potato Dextrose Agar, sebagian dimasukkan ke dalam tabung reaksi @ 5 ml untuk media agar miring, sisanya dimasukkan dalam labu erlenmenyer.

  2. Disterilkan media pada 121^oC selama 15 menit.

  3. Dibuat serangkaian pengenceran sampel tanah dari 10^1 - 10^6.

  4. Dari pengenceran tertinggi dimasukkan 1 ml suspensi fungi ke dalam cawan petri steril, meratakan pada dasar cawan dengan digoyangkannya.

  5. Dituang cawan-cawan yang berisi suspensi dengan 10-15 ml dengan media PDA bersuhu 45^oC, digoyang dengan dibentuk angka delapan dan dibiarkan memadat.

  6. Diinkubasi terbalik pada 28^oC selama 2 x 24 jam.

  7. Dari koloni yang terpisah dimurnikan secara goresan. Selanjutnya dipindahkan ke media agar miring.

Daftar Pertanyaan

  1. Mengapa pada waktu sebelum dan sesudah menginokulasikan mikrobia, jarum inokulasi harus dibakar sempurna?

  2. Dalam menginkubasi mikrobia pada cawan petri selalu dalam posisi terbalik, jelaskan?

  3. Bagaimana menurut saudara jika bakteri yang tumbuh berada diluar goresan?

  4. Mengapa dalam mengisolasi fungsi pada satu titik sering tumbuh beberapa titik?

  5. Bagaimana anda yakin jika isolat telah berada dalam keadaan murni (purity)?

Daftar Pustaka

  • Hadioetomo, RS. 1994. Mikrobiologi Dasar dalam Praktik : Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.

PRAKTIKUM 4. KUANTITASI MIKROBIA

Tujuan

Mengenalkan mahasiswa terhadap metode-metode perhitungan populasi mikrobia.

Landasan Teori

Metode untuk menghitung jumlah mikroba:

  1. Metode menghitung cawan untuk perhitungan mikroba yang hidup dan mati.

  2. Metode MPN (Most Probable Number) untuk menghitung mikroba yang hidup.

  3. Metode menghitung mikroskopi langsung (menggunakan alat).

  4. Metode turbidimetri (menggunakan alat spektrofotometri dengan melihat kekeruhan dan cara untuk ini harus dengan preparat yang jernih, jadi tidak dapat untuk pangan).

Metode yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam bahan pangan terdiri dari metode hitungan cawan, “Most Probable Number” (MPN), dan metode hitungan mikroskopik langsung. Metode hitungan cawan paling banyak digunakan. Metode lainnya adalah metode turbudimetri (kekeruhan) menggunakan spektofotometer. Tetapi metode ini sukar ditetapkan pada bahan pangan karena medium yang diukur harus bening, sedangkan ekstrak bahan pangan, misalnya sari buah, biasanya mengandung komponen-komponen yang menyebabkan kekeruhan larutan tidak sebanding dengan jumlah mikroba yang terdapat di dalamnya.

Metode hitungan cawan didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni, jadi jumlah koloni yang muncul pada cawan merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terkandung dalam sampel. Teknik yang harus dikuasi dalam metode ini adalah mengencerkan sampel dan mencawankan hasil pengenceran tersebut.

Metode Standart Plate Count merupakan salah satu jenis metode yang digunakan untuk menghitung jumlah populasi mikrobia. Metode ini dilakuakan dengan cara menghitung secara langsung jumlah populasi mikroba, pada suatu bahan, pada suatu saat tertentu tanpa memberikan perlakuan terlebih dahulu. Metode MPN merupakan salah satu metode perhitungan secara tidak langsung. Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive test), uji konfirmasi (confirmed test), dan uji kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap pertama, keberadaan coliform masih dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi sifat fermentatif coliform dalam sampel.

Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk-koloni (colony-forming unit) dalam sampel. Namun, pada umumnya, nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi.

Metode perhitungan mikroskopis secara langsung dilakukan dengan cara sampel ditaruh di suatu ruang hitung (hemasitometer) dan jumlah sel dapat ditentukan secara langsung dengan bantuan mikroskop. Keuntungan metode ini adalah pelaksanannya cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan. Kelemahannya adalah tidak dapat membedakan sel-sel yang hidup dari sel-sel yang mati, dengan perkataan lain hasil yang diperoleh adalah jumlah total sel yang ada di dalam populasi. Penambahan zat warna tertentu (misalnya biru metilen sebanyak 0,1%) pada sampel yang akan dihitung dapat membedakan sel hidup dan sel mati.

Perhitungan jumlah bakteri total menghitung semua bakteri baik hidup maupun mati, caranya ialah sebagai berikut :

  1. Menghitung langsung di bawah mikroskop menggunakan kamar hitung.

  2. Menghitung dalam alat penghitung elektronik yaitu dalam alat penghitung Coulter.

  3. Perhitungan langsung dengan menggunakan sediaan yang telah diwarnai dengan cara menyebarkan suatu jumlah tertentu pada suatu daerah dengan luar tertentu pada gelas alas.

  4. Membandingkan jumlah relatif dengan jumah sel lain yang telah diketahui pada sediaan dari biakan campuran.

  5. Dengan mengukur kekeruhan dengan nephalometer atau adsorptiometer.

  6. Mengukur berat sel basah dan kering sesudah pemusingan dan penyaringan. Pengukuran kadar nitrogen secara kimiawi.

Alat dan Bahan

Tabung reaksi, tabung durham, alkohol 70%, erlenmeyer, efendorf pipet, api bunsen dan inkobator, media LB dan NA. Bahan yang digunakan adalah daging segar, daging kaleng, dan aquades.

Prosedur Kerja

Metode MPN

  1. Disiapkan sampel yang sudah dihancurkan dan ditambahkan akuades

  2. Disiapkan 15 tabung reaksi yang sudah diisi dengan tabung durham dan media dengan ketentuan 5 tabung berisi 5 ml media dengan kriteria Double Strength (DS), dan 10 tabung berisi 9 ml media dengan kriteria Single Strength (SS)

  3. Diisikan 5 tabung yang berisi 5 ml media dengan kriteria Double Strength (DS) dengan 5 ml sampel, sterilkan muara tabung sebelum dan sesudah menambahkan sampel

  4. Diisikan 5 tabung yang berisi 9 ml media dengan kriteria Double Strength (SS) dengan 1,0 ml sampel, sterilkan muara tabung sebelum dan sesudah menambahkan sampel

  5. Diisikan 5 tabung yang berisi 9 ml media dengan kriteria Double Strength (SS) dengan 0,1 ml sampel, sterilkan muara tabung sebelum dan sesudah menambahkan sampel Diletakkan erlenmeyer berisi aquades di atas hot plate

  6. Tabung-tabung tersebut diinkubasi 1 × 24 jam

  7. Dihitung jumlah tabel yang positif yang ditandai dengan adanya gas pada tabung durham

  8. Dicatat hasil pengamatan dan dihitung dengan tabel MPN. Hasil tersebut menyatakan MPN coli fecal

Metode TPC

  1. Diambil 1 ml sampel yang sudah di hancurkan dan ditambahkan akuades

  2. Diencerkan sampai 10^{-4} (karena merupakan sampel padat, maka ketika pengahancuran bahan sudah dianggap sudah mengalami pengenceran 10^{-1}). Dengan mulut tabung reaksi yang dipanaskan terlebih dahulu dengan api bunsen.

  3. Diambil 1 ml sampel pada setiap pengenceran dan dimasukkan ke cawan petri yang sudah disterilkan dengan sistem doplo

  4. Ditambahkan media NA

  5. Cawan petri dipanaskan sekelilingnya dengan api.

  6. Diinkubasi selama 1 × 24 jam

  7. Dihitung koloni bakteri yang ada dengan colony counter

Daftar Pertanyaan

  1. Buatlah skema prosedur kerja untuk standar plate count?

  2. Buatlah skema prosedur kerja untuk metode MPN secara garis besar?

  3. Medium yang digunakan dalam uji MPN bersifat?

  4. Jelaskan apa yang dimaksud dengan bakteri coliform?

Daftar Pustaka

  • Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.

  • Gupte, S. 1990. Mikrobiologi Dasar Edisi 3. Jakarta, Binarupa Aksara.

  • Hadioetomo, RS. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek: Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.

  • Lim, D. 1998. Microbiology, 2 nd Edition. Mc Rrow Hill Book, New York.

  • Schlgree, HG. 1996. General Microbiology. Cambrige University Press, Australia.